本文關(guān)鍵詞：H-2K~d-抗原肽復(fù)合物表面展示脂質(zhì)體的制備及初步鑒定　出處：《揚州大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 本研究首先試圖克隆、表達(dá)和純化小鼠H-2K~d、β2m分子。利用RT-PCR技術(shù)從SP2/0細(xì)胞中擴(kuò)增出H-2K~d胞外區(qū)全長cDNA,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到H-2K~d基因,并在H-2K~d的羧基末端選擇性地加入6-his(組氨酸)的標(biāo)簽。成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b-H-2K~d。誘導(dǎo)表達(dá)的H-2K~d和β2m蛋白主要以包涵體形式存在,采用洗滌包涵體的方法純化H-2K~d和β2m蛋白。然后在谷胱苷肽氧化還原系統(tǒng)中,利用稀釋折疊復(fù)性的方法將蛋白H-2K~d、β2m和H-2K~d限制性的流感病毒九肽一起復(fù)性,再經(jīng)過超濾濃縮和Sephacryl-300柱層析純化,獲得特異性的H-2K~d-抗原肽復(fù)合物。 以二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、膽固醇(CHOL)和鎳金屬螯合磷脂(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- [N-(5-amino-1- carboxypentyl) iminodiacetic acid] succinyl , DOGS-NTA-Ni)為脂質(zhì)材料,采用薄膜-超聲分散法制備DOPC/DOGS-NTA-Ni脂質(zhì)體,并利用激光動態(tài)光散射儀和透射電子顯微鏡分析脂質(zhì)體的形態(tài)分布、粒徑大小等特征。結(jié)果顯示DOPC/DOGS-NTA-Ni脂質(zhì)體平均粒徑約為75nm,脂質(zhì)體的表面形態(tài)圓整,光滑。 在上述工作的基礎(chǔ)上,我們將H-2K~d-抗原肽復(fù)合物和DOPC/DOGS-NTA-Ni脂質(zhì)體按濃度比2∶1等體積混合,4℃條件下孵育過夜,期望把羧基末端含有6-his-tag的H-2K~d-抗原肽復(fù)合物展示在脂質(zhì)體的表面。激光動態(tài)光散射儀發(fā)現(xiàn)H-2K~d-抗原肽復(fù)合物表面展示后脂質(zhì)體的粒徑比空白脂質(zhì)體的粒徑增大,平均粒徑約為94 nm。透射電鏡觀察結(jié)果顯示H-2K~d-抗原肽復(fù)合物能夠展示在DOPC/DOGS-NTA-Ni脂質(zhì)體表面。 本實驗研究成功地將H-2K~d-抗原肽復(fù)合物展示在脂質(zhì)體表面,為進(jìn)一步構(gòu)建以脂質(zhì)體為載體的小鼠人工抗原遞呈細(xì)胞的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
[Abstract]:The H - 2K ~ d and 尾2m proteins were amplified from SP2 / 0 cells by RT - PCR . The H - 2K ~ d and 尾2m proteins were amplified by polymerase chain reaction . The H - 2K ~ d and 尾2m proteins were purified by polymerase chain reaction . DOPC / DOGS - Ni liposome was prepared by a thin film - ultrasonic dispersion method . The results showed that the average particle size of DOPC / DOGS - Ni liposome was about 75nm , and the surface morphology of the liposome was smooth and smooth . On the basis of the above work , H - 2K ~ d - antigen peptide complexes and DOPC / DOGS - Ni liposome were mixed at a concentration ratio of 2 : 1 . The complexes of H - 2K ~ d - antigen peptide with 6 - his - tag were displayed on the surface of liposomes at 4 鈩，

本文編號：1377588