發(fā)布時間：2018-01-04 05:34

  本文關(guān)鍵詞：小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的建立及其分化研究　出處：《鄭州大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 樹突狀細(xì)胞 分化 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 免疫治療 小鼠

【摘要】：樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)屬于專職抗原遞呈細(xì)胞,其能攝取、加工、處理和遞呈抗原,并將后者攜帶的信息呈遞給T淋巴細(xì)胞,進而引發(fā)一系列免疫應(yīng)答,其效率是所有該類細(xì)胞中最強的。DC參與多種病理生理過程,并具有強大的免疫調(diào)節(jié)功能,因此以DC為基礎(chǔ)的免疫治療已成為腫瘤治療的一種新模式。然而DC獲取困難,通過患者自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)和擴增后獲取自體內(nèi)源性DC,技術(shù)操作困難,且患者難以承受,其療效目前尚有爭議,不適合臨床廣泛應(yīng)用。通過胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESC)定向分化制備DC,則具有倫理學(xué)限制,而且所得DC并非自體細(xì)胞,存在免疫排斥的可能。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)技術(shù)的出現(xiàn)則為臨床上DC的腫瘤免疫治療所需的種子細(xì)胞的制備提供了另一種新途徑。iPSCs是由體細(xì)胞誘導(dǎo)而成的干細(xì)胞,具有和ESC類似的發(fā)育多潛能性,在形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)狀況和表觀遺傳修飾方面都與ESC十分相似。iPSCs的應(yīng)用價值在于獲得方法相對簡單和穩(wěn)定,在技術(shù)上和倫理上都比其他方法更有優(yōu)勢,在再生醫(yī)學(xué)中起著非常重要的作用。 鑒于此,本研究擬通過多因子重編程技術(shù),誘導(dǎo)小鼠成熟體細(xì)胞為iPSCs,并利用免疫組織化學(xué)、熒光、擬胚體(EB)實驗、RT-PCR及Western blot等多項形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)對誘導(dǎo)而來的iPSCs進行分析鑒定。最后通過在iPSCs培養(yǎng)基中分別單獨或聯(lián)合添加不同的促使DC生長的細(xì)胞營養(yǎng)因子,將iPSCs在體外定向誘導(dǎo)分化為DC。 目的 利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng),通過病毒包裝技術(shù),將小鼠成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs并對其進行鑒定。并在此基礎(chǔ)上,將iPSCs在體外定向誘導(dǎo)分化為DC。 材料與方法 第一部分是iPSCs的誘導(dǎo)與鑒定。方法如下：采用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的方法將4種外源多能因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入病毒包裝Plat-E細(xì)胞,搜集病毒上清感染原代培養(yǎng)的小鼠鼠尾成纖維細(xì)胞,觀察記錄多能干細(xì)胞誘導(dǎo)生成的過程,并對其進行鑒定分析。主要采取以下鑒定方法,1)采用堿性磷酸酶(AP)染色觀察未分化的iPSCs是否具備ESC的特征,再結(jié)合形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)的觀察,鑒定iPSCs是否具有全能性；2)采用免疫熒光的方法鑒定干細(xì)胞標(biāo)志物Oct、Sox2、SSEA-1在誘導(dǎo)而來的iPSCs表面的表達(dá)；3)擬胚體(EB)實驗檢測是否iPSCs能夠分化發(fā)育成胚體,并用免疫熒光的方法檢測胚體中是否存在3個胚層來源細(xì)胞；4) Western blot檢測多能基因的蛋白表達(dá)：為進一步驗證感染小鼠成纖維細(xì)胞的多能基因蛋白表達(dá)情況,利用Western blot方法檢測已誘導(dǎo)成功的iPSCs多能因子的蛋白表達(dá)情況。所用Western抗體同免疫組化抗體；5)基因表達(dá)分析(RT-PCR):采用RT-PCR分別檢測Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4多能基因在成功誘導(dǎo)的iPSCs、ESC M1及小鼠成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平,并作對比分析。 第二部分為iPSCs分化為DC的研究。方法如下：將誘導(dǎo)成功的iPSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)體系內(nèi)分別單獨或聯(lián)合添加不同的細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素IL-3(10ng/mL), IL-7(10ng/mL), IL-15(20ng/mL)。每2-3d半量換液,添加新鮮細(xì)胞因子。培養(yǎng)12～14d后,繼續(xù)添加細(xì)胞因子粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)(4ng/mL)(?)腫瘤壞死因子(TNF)(50ng/mL),繼續(xù)培養(yǎng)3～5d,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 結(jié)果 1鼠尾成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及iPSCs的誘導(dǎo) 采用胰酶消化法原代培養(yǎng)鼠尾成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)次日,倒置相差顯微鏡下觀察即可見典型的成纖維細(xì)胞特征；之后進行iPSCs的誘導(dǎo),多能干細(xì)胞因子病毒感染第2d即可觀察到成纖維細(xì)胞形態(tài)開始變化,細(xì)胞變平,較圓,同時出現(xiàn)小集落狀的增殖群體。兩周后可出現(xiàn)大量的致密而突起的克隆,細(xì)胞排列緊密,界限較清,集落邊緣折光強。采用機械法挑取克隆并進行傳代。 2iPSCs的鑒定 我們分別利用AP染色法、EB實驗、Western blot及免疫熒光染色法對誘導(dǎo)成的iPSCs進行了鑒定,鑒定結(jié)果均符合ESC的特征；采用RT-PCR的方法檢測多能基因mRNA水平,可見所建立的iPSCs細(xì)胞系與ESC相同,均表達(dá)內(nèi)源性的Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4,而分化后的成纖維細(xì)胞不表達(dá)干細(xì)胞全能性基因Oct4；由于外源基因的導(dǎo)入,所建立的iPSCs細(xì)胞系外源基因RNA水平較高,而小鼠ESC和小鼠成纖維細(xì)胞外源性基因幾乎完全沉默。 3體外誘導(dǎo)iPSCs向DC分化 體外誘導(dǎo)iPSCs向DC分化主要是采取在iPSCs培養(yǎng)基中添加幾種能使干細(xì)胞向DC分化的營養(yǎng)因子,如IL、GM-CSF、TNF、干細(xì)胞生長因子以及DC促生長因子FMS樣酪氨酸激酶3配體(FIt3L)、脂多糖等。結(jié)果可見典型的DC形態(tài),提示iPSCs在特定因子的誘導(dǎo)下是可以分化為DC的。 結(jié)論 通過4種外源多能因子的轉(zhuǎn)導(dǎo),小鼠鼠尾成纖維細(xì)胞成功誘導(dǎo)為iPSCs,并具有iPSCs的功能和形態(tài)特征； iPSCs在特定因子的誘導(dǎo)下,可以成功分化為DC,具備DC的表型特征； 不但為臨床上DC的腫瘤免疫治療所需的種子細(xì)胞提供了一種新的來源,同時也有助于我們了解胚胎時期DC的發(fā)育及其免疫調(diào)節(jié)作用,為臨床疾病防治和藥物研究提供非常有價值的實驗平臺。
[Abstract]:Dendritic cells (dendritic, cells, DC) are professional antigen presenting cells, the uptake, processing, processing and presenting antigens, and the latter will carry the information presentation to T cells, triggering a series of immune response, its efficiency is the strongest of all the cells in the.DC involved in many physiological and pathological processes, and has strong immune regulating function, so DC based immunotherapy has become a new model for tumor therapy. However, DC are difficult to obtain, through autologous bone marrow mesenchymal stem were isolated and amplified in DC cells for autologous source technology, difficult operation, and the patient is difficult to bear, its efficacy is controversial that is not suitable for clinical application. The embryonic stem cells (embryonic stem cell, ESC) differentiation of DC was prepared with ethical restriction, and the DC is not stored in the autologous cells, immune rejection may be induced. Pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells iPSCs) technology is the emergence of the seed cells for tumor immunotherapy clinical DC required for the preparation of a new way of.IPSCs is induced by somatic cells into stem cells, has the development potential, and ESC similar in morphology that gene expression and epigenetic modifications are very similar with ESC value of.IPSCs is to obtain the method is relatively simple and stable in technology and ethics have more advantages than other methods, plays a very important role in regenerative medicine.
In view of this, this study proposed by multi factor reprogramming, mature somatic cells in mice induced by iPSCs, and the use of immunohistochemistry, fluorescence, embryoid body (EB) experiment, while RT-PCR and Western to blot and a number of morphological and molecular biology techniques to analyze the identification of induced iPSCs. Finally, in the iPSCs culture medium respectively alone or in combination with added neurotrophic factor promotes DC growth of different iPSCs in the differentiation of DC.
objective
The mouse fibroblast was reprogrammed into iPSCs and identified by retrovirus vector system. Based on that, iPSCs was induced to differentiate into DC. in vitro.
Materials and methods
The first part is the induction and identification of iPSCs. The method is as follows: using the method of retroviral transfection of 4 kinds of exogenous multi factor Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 plasmid was transfected into Plat-E cells the virus packaging, collect virus supernatant of mice infected rat primary cultured tail fibroblasts, observe the recording process induced pluripotent stem cell generation, and carries on the appraisal analysis. Mainly take the following identification methods, 1) using alkaline phosphatase (AP) staining was observed in undifferentiated iPSCs have the characteristics of ESC, combined with the observation of morphology and immunocytochemistry, identification of totipotency is iPSCs; 2) were identified by immunofluorescence method of stem cell marker Oct, Sox2, SSEA-1 and iPSCs in the induction of surface expression; 3) embryoid bodies (EB) test whether iPSCs can differentiate into embryo development, and detected by immunofluorescence in the embryo of the existence of 3 Ectoderm derived cells; 4) expression of Western blot gene can detect protein: to further validate the infection of mouse fibroblasts to gene expression, the expression is detected by Western blot method has been successfully induced pluripotent iPSCs protein. The factor Western antibody with immunohistochemistry antibody; 5) gene expression analysis (RT-PCR) were determined with RT-PCR Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 can be successfully induced gene in iPSCs, ESC and M1 in the expression level of fiber cells, and make comparative analysis.
The second part is the differentiation of iPSCs into DC. The method is as follows: the basis of successful induced iPSCs culture system were added alone or in combination with different cytokines, such as interleukin IL-3 (10ng/mL), IL-7 (10ng/mL), IL-15 (20ng/mL). Each 2-3D was half changed, adding fresh cytokines training. After 12 ~ 14d, continue to add the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) (4ng/mL) (?) tumor necrosis factor (TNF) (50ng/mL), cultured for 3 ~ 5D, the cells were observed under inverted microscope.
Result
The culture of 1 rat tail fibroblasts and the induction of iPSCs
Using trypsin digestion method cultured rat tail fibroblasts cultured on the next day, observed under inverted phase contrast microscope which showed typical fibroblast characteristics; then iPSCs induced pluripotent stem cell factor 2D virus infection can be observed the morphology of fibroblasts cells began to change, flattened, rounded and small colony like proliferation group. Two weeks after the emergence of a large number of dense and protruding cloned cells arranged closely, well-defined, colony edge. Positive clones and strong refraction were passaged by mechanical method.
Identification of 2iPSCs
We use AP staining method, EB experiments on induction into the iPSCs blot and Western were identified by immunofluorescence staining, the identification results are consistent with the characteristics of ESC; using RT-PCR method to detect multiple gene mRNA levels, visible established cell line iPSCs and ESC were the same, the endogenous expression of Oct4, Sox2. C-Myc, Klf4, and the differentiation of fibroblasts did not express stem cell pluripotency gene Oct4; due to the introduction of exogenous gene, iPSCs cell line RNA gene high level of ESC and mouse fibroblasts of exogenous gene almost completely silent.
3 differentiation of iPSCs into DC in vitro
In vitro differentiation of DC to iPSCs is mainly adopted in the iPSCs culture medium can add several stem cells to the differentiation of DC nutritional factors, such as IL, GM-CSF, TNF, stem cell growth factor and DC growth factor FMS like tyrosine kinase 3 ligand (FIt3L) and lipopolysaccharide. The results showed typical morphology of DC, suggesting that iPSCs in the induction of specific factors can be differentiated into DC.
conclusion
Through the transduction of 4 exogenous pluripotent factors, the mouse tail fibroblasts were successfully induced to be iPSCs, and had the functional and morphological characteristics of iPSCs.
Under the induction of specific factors, iPSCs can successfully differentiate into DC and possess the phenotypic characteristics of DC.
It not only provides a new source of seed cells for tumor immunotherapy in DC, but also helps us to understand the development of DC and its immunomodulatory effect in embryo, providing a valuable experimental platform for clinical disease prevention and drug research.

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 韓忠朝;;多能干細(xì)胞研究新進展[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2008年10期

2 ;用頭發(fā)培育多能干細(xì)胞獲得成功[J];生物醫(yī)學(xué)工程研究;2009年01期

3 金穎;;多能干細(xì)胞研究進展[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2009年05期

4 林曉龍;姜樺;陳彤;;誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究進展及應(yīng)用前景[J];中國醫(yī)藥生物技術(shù);2010年01期

5 景毅;楊秀霞;;誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究概況[J];科技資訊;2010年15期

6 劉雪霞;李建遠(yuǎn);;誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究進展[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2010年09期

7 石宏偉;唐其柱;張衛(wèi)國;舒勝強;;誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞研究進展[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2010年12期

8 ;維生素C可提高多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率[J];科技與企業(yè);2010年03期

9 李紅;多能干細(xì)胞——發(fā)育毒性研究的新思路[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);2004年03期

10 王士雯;李泱;;多能干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用及中藥的調(diào)節(jié)效應(yīng)[J];中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測;2004年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 卞合濤;黃衛(wèi);;誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞[A];中華醫(yī)學(xué)會第十三次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

2 柯昌能;利天增;徐盈斌;祁少海;黃冰;謝舉臨;;老年人皮膚多能干細(xì)胞的分離及有效擴增[A];第八屆全國燒傷外科學(xué)年會論文匯編[C];2007年

3 邱慧穎;王健民;夏榮;周虹;龔勝藍(lán);高磊;解琳娜;胡曉霞;;小鼠骨髓多能干細(xì)胞體外培養(yǎng)建系及其生物學(xué)特性研究[A];第10屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2005年

4 章小清;;多能干細(xì)胞神經(jīng)分化:神經(jīng)系統(tǒng)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究的橋梁[A];中國神經(jīng)科學(xué)學(xué)會第九屆全國學(xué)術(shù)會議暨第五次會員代表大會論文摘要集[C];2011年

5 范力星;冀凱宏;熊俊;胡凱猛;劉厚奇;;骨髓源性多能干細(xì)胞(MMSC)向多巴胺能神經(jīng)元的體外分化[A];中國解剖學(xué)會第十一屆全國組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2009年

6 趙春華;房柏俊;廖聯(lián)明;史明霞;楊少光;;人胎兒來源Flk1~+CD34~-表型多能干細(xì)胞分離與鑒定(英文)[A];中國微循環(huán)學(xué)會第五屆中國微循環(huán)學(xué)術(shù)大會論文摘要匯編[C];2004年

7 林炳亮;高志良;;骨髓干細(xì)胞移植的研究現(xiàn)狀[A];廣東省肝臟病學(xué)會2007年年會論文集[C];2007年

8 姚海雷;張文成;王思涵;李保偉;張銳;習(xí)佳飛;周軍年;呂洋;曾泉;施雙雙;何麗娟;南雪;李艷華;岳文;裴雪濤;;誘導(dǎo)臍帶血來源的CD34+細(xì)胞重編程獲得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS cells)[A];第12屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要[C];2009年

9 李恩琴;金潤銘;;兒童誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的建立與造血分化[A];中華醫(yī)學(xué)會第十七次全國兒科學(xué)術(shù)大會論文匯編（上冊）[C];2012年

10 劇世強;芮榮;;MicroRNA在多能干細(xì)胞的表達(dá)與功能[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物繁殖學(xué)分會第十六屆學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2012年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 張磊;我國培育出多能干細(xì)胞克隆豬[N];健康報;2013年

2 記者 葉青;體細(xì)胞“變身”機制明確了[N];廣東科技報;2010年

3 記者 林亞茗　通訊員 韓青海 李潔蔚 朱丹萍;尿液中誘導(dǎo)出多能干細(xì)胞[N];南方日報;2011年

4 ;維生素C打開多能干細(xì)胞治病之門[N];南方日報;2011年

5 錢洛瀅 記者 王春;乳腺中發(fā)現(xiàn)多能干細(xì)胞[N];科技日報;2014年

6 記者 顧鋼;德科學(xué)家找到感應(yīng)多能干細(xì)胞[N];科技日報;2009年

7 記者 張建華;糖尿病、地貧癥或?qū)⒃庥隹诵荹N];人民日報海外版;2011年

8 記者 常麗君;美用多能干細(xì)胞培育出胃組織[N];科技日報;2014年

9 常麗君;吸脂術(shù)去除的脂肪含新型多能干細(xì)胞[N];科技日報;2013年

10 葛進;日發(fā)現(xiàn)多能干細(xì)胞向外胚葉分化控制基因[N];科技日報;2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前7條

1 邱慧穎;小鼠骨髓多能干細(xì)胞建系及其造血重建作用的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

2 史春夢;真皮來源成體多能干細(xì)胞的生物學(xué)性狀與促進創(chuàng)傷修復(fù)的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

3 趙宏喜;克服多能干細(xì)胞移植免疫排斥反應(yīng)的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2009年

4 劉麗;小鼠誘導(dǎo)式多能干細(xì)胞向牙源性細(xì)胞分化的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2012年

5 張麗飛;人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞人源化培養(yǎng)體系的建立和研究[D];浙江大學(xué);2013年

6 王穎佳;WAS綜合征特異性無整合誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞體外造血分化及基因靶向編輯研究[D];浙江大學(xué);2013年

7 李恩琴;兒童急性早幼粒細(xì)胞白血病的臨床及相關(guān)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞研究[D];華中科技大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 勞滔滔;人和小鼠多能干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)[D];浙江大學(xué);2003年

2 張翠平;誘導(dǎo)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞為多能干細(xì)胞的共孵育方法研究[D];西南大學(xué);2012年

3 韓升霞;人體細(xì)胞體外重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞關(guān)鍵技術(shù)的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2013年

4 劉海明;小鼠胚胎成纖維細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞的實驗研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

5 張向前;小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的建立及其分化研究[D];鄭州大學(xué);2013年

6 唐海燕;人包皮成纖維細(xì)胞體外誘導(dǎo)重編程為多能干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

7 李勇鐵;人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向表皮樣干細(xì)胞分化的初步研究[D];南昌大學(xué);2011年

8 朱恒濤;誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞正常小鼠耳蝸內(nèi)移植的實驗研究[D];南昌大學(xué);2014年

9 張新民;多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子及其家族蛋白的生物信息學(xué)分析[D];內(nèi)蒙古師范大學(xué);2013年

10 楊越飛;誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞為多能干細(xì)胞的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2011年

，

本文編號：1377295