本文關(guān)鍵詞：重組肺炎鏈球菌HMGR特性分析及抑制劑篩選　出處：《華中師范大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：肺炎鏈球菌(Streptoccus pneumoniae)是引起腦膜炎、菌血癥、肺炎等疾病的主要致病菌,近年來由于環(huán)境污染和抗生素的亂用而造成多藥抗性的肺炎鏈球菌菌株逐年增加,對抗生素的抗性逐年增強。HMG-CoA還原酶(HMG-CoA reductase,HMGR)是甲羥戊酸(mevalonate)途徑的限速酶,催化HMG-CoA還原為甲羥戊酸。本研究從肺炎鏈球菌基因組DNA中PCR擴增出mvaA基因全長1275bp的完整編碼序列,將其克隆到pMD18-T載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切分析并測序證實的陽性重組子亞克隆到pET-28a(+)表達載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。在30℃以1mM IPTG誘導(dǎo)表達,Ni-NTA層析柱分離純化后經(jīng)SDS-PAGE分析表明在約47kD處有特異性表達帶。肺炎鏈球菌HMGR以NADPH作為輔酶,動力學(xué)分析采用紫外分光光度法檢測NADPH在340nm處吸收值的變化。檢測結(jié)果表明肺炎鏈球菌HMGR的最適pH約為6.5,最適溫度37℃。粗酶提取物的比活為11.22U/mg,分離純化后比活為31.98U/mg,比活提高2.8倍。在37℃,pH6.5時的Vmax和Km分別為62.1U/mg和260μM。羅伐他汀是HMGR的競爭性抑制劑,對肺炎鏈球菌HMGR的抑制常數(shù)Ki為362μM。表達純化后的重組HMGR免疫新西蘭大白兔,提取抗血清,ELISA檢測其效價為1:320000,Western雜交證明HMGR具有特異性雜交條帶。 序列分析表明,HMGR主要存在兩類,Ⅰ類主要存在于真核生物和部分古細菌中,Ⅱ類主要存在于原核生物和部分古細菌中。他汀類藥物是Ⅰ類HMGR的良好競爭性抑制劑,其Ki常數(shù)在nM范圍內(nèi),但是他汀類藥物對Ⅱ類HMGR的抑制效果并不明顯,其Ki值在μM范圍內(nèi)。為了尋找更專一有效的針對Ⅱ類HMGR的競爭性抑制劑,本文以假單孢桿菌HMGR晶體結(jié)構(gòu)為模板,通過SYBYL7.0軟件,用同源模建的方法分析了肺炎鏈球菌HMGR的三維結(jié)構(gòu),根據(jù)其同源模建和三維結(jié)構(gòu)篩選HMGR的競爭性抑制劑。用重組表達的肺炎鏈球菌HMGR,檢測篩選到的抑制劑的抑制效果。初步分析結(jié)果表明,在待篩選的30種化合物中,篩選到一種比傳統(tǒng)的競爭性抑制劑羅伐他汀具有更佳抑制效果的化合物,其抑制常數(shù)Ki約為76μM,此種化合物可作為進一步研究新型抗菌藥物的預(yù)選藥物。目前,以計算機分析三維結(jié)構(gòu)為手段,用同源模建的方法尋找結(jié)構(gòu)類似物來研究新藥的開發(fā)是一種有效的途徑,本實驗為進一步尋找專一性的特效抑制劑奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Streptoccus pneumoniae is the main pathogen causing meningitis, bacteremia, pneumonia and other diseases. In recent years, Streptococcus pneumoniae strains with multi-drug resistance caused by environmental pollution and indiscriminate use of antibiotics increased year by year. HMG-CoA reductase (HMG-CoA reductase) is the rate-limiting enzyme of mevalonate pathway. In this study, the complete coding sequence of mvaA gene 1275bp was amplified from the genomic DNA of Streptococcus pneumoniae by catalytic reduction of HMG-CoA to mevalic acid. It was cloned into pMD18-T vector. The recombinant plasmid was subcloned into the expression vector pET-28a (pET-28a ()) by Hind 鈪，

本文編號：1375901