本文關鍵詞：CD45，，CD90對分離得到大鼠骨髓間充質干細胞純度的鑒定　出處：《中國醫(yī)科大學》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 目的 探討大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BW-MSCs)的分離方法;應用流式細胞儀,用小鼠抗大鼠CD45, CD90檢測分離得到BW-MSCs的純度。 方法 在無菌條件下,采集雙側股骨,脛骨,用適量DMED／F12培養(yǎng)液沖出骨髓。用比重為1.073g／ml的Percol1分離液分離,取界面層,獲取單個核細胞,用PBS液以1 000r／min離心洗滌,每次10 min,共2次。分離的細胞以5×104／cm2個接種于培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)體系為高糖EMDM/F12(1:1),20%胎牛血清。在37℃,體積分數(shù)為5%CO2條件下培養(yǎng),首次24 h更換培養(yǎng)液,去掉未貼壁細胞。每3d換液1次。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。當細胞達到80%融合時,用1：1的0.1%胰蛋白酶和0.01%EDTA混合液消化,用含2%小牛血清的PBS洗滌后制成1.0×107／ml骨髓MSCs的單細胞懸液,加入EP管中。之后按說明,取一定量CD90-FITC和CD45-PE加入EP管中。4℃避光孵育30min,流式細胞儀檢測。 結果 1、采用密度梯度離心法和貼壁法相結合可從大鼠骨髓中分離出骨髓間充質干細胞。新鮮分離細胞在倒置顯微鏡下觀察呈圓形,大小不均一。24 h細胞貼壁,更換培養(yǎng)液后,見貼壁細胞呈圓形,橢圓形,多邊形。48 h見貼壁細胞體積變大,大小不均一,其漿核分界清楚,折光性強。絕大多數(shù)為單核,圓形,位于細胞中心位置。而后細胞形態(tài)仍然以圓形,橢圓形為主,長梭形的細胞逐漸出現(xiàn)。10-12天后大部分細胞變?yōu)殚L梭形,少部分呈多角形。12天左右可達80%融合。2、密度梯度離心法分離和貼壁法相結合得到的細胞,經(jīng)小鼠抗大鼠CD90-FITC和CD45-PE雙染后,應用流式細胞儀檢測三次實驗分離得到的細胞,CD9+CD45細胞的百分比40.02%,43.80%,42.63%。 結論 1、用比重為1.073g／ml的Percoll分離液離心之后貼壁培養(yǎng)可從大鼠股骨脛骨中分離得到骨髓間充質干細胞。2、CD45, CD90雙染鑒定密度梯度離心法與貼壁法相結合分離得到骨髓間充質干細胞的百分比約為42.15%。
[Abstract]:Purpose To investigate the isolation method of bone marrow mesenchymal stem cells (BW-MSCs) from rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). The purity of BW-MSCs was determined by flow cytometry, anti-rat CD-45 and CD90. Method Under aseptic condition, bilateral femur and tibia were collected and the bone marrow was washed out with proper amount of DMED/F12 culture medium. The interfacial layer was separated with 1.073 g / ml Percol1 separation solution. Mononuclear cells were obtained and washed by centrifugation with PBS solution for 10 min each time. The isolated cells were inoculated in culture flask with 5 脳 10 4 / cm 2 cells for 2 times. The culture system was high sugar EMDM / F12: 1: 1% fetal bovine serum at 37 鈩

本文編號：1366876