本文關(guān)鍵詞：RNAi沉默卡氏肺孢子MSG-UCS基因表達的研究　出處：《重慶醫(yī)科大學》2008年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 目的:本研究旨在應(yīng)用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù),構(gòu)建卡氏肺孢子(Pneumocystis carinii,PC)主要表面糖蛋白(Major surface glycoprotein,MSG)表達調(diào)控基因上游保守序列(Upstream conserved sequence,UCS)的小干擾RNA(short interfering RNA,siRNA)表達載體,并將其轉(zhuǎn)染到PC中有效表達后,研究其對PC的抑制作用。 方法:設(shè)計并人工合成針對PC MSG-UCS基因的短發(fā)夾狀(Short hairpin RNA,shRNA)序列并定向克隆到siRNA表達載體pTZU6+1上,采用雙酶切與測序法進行鑒定;將構(gòu)建成功的主要表面糖蛋白UCS基因siRNA表達載體pPC-UCS體外轉(zhuǎn)染到PC中,用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染48小時后UCS基因的表達,在掃描電鏡下觀察PC的超微結(jié)構(gòu)變化;將表達載體pPC-UCS用水動力法注射到PCP大鼠體內(nèi),48小時后進行以下檢查:大鼠肺印片記數(shù)包囊、觀察肺組織病理改變、電鏡檢測PC的超微結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果:酶切和測序鑒定得到的產(chǎn)物與預期目的基因一致;體外轉(zhuǎn)染pPC-UCS的PC中UCSmRNA表達水平降低,與對照組相比,結(jié)果具有顯著性差異,UCSmRNA的抑制率為77.47%;轉(zhuǎn)染pPC-UCS48小時后,在掃描電鏡中觀察PC,可見PC水腫脹大,微絨毛脫落,表膜破裂,出現(xiàn)破損。體內(nèi)轉(zhuǎn)染pPC-UCS 48h后,包囊減少率為67.88%,與對照組相比,結(jié)果具有顯著性差異;大鼠肺泡炎減輕,與對照組相比,結(jié)果具有顯著性差異;掃描電鏡觀察可見PC水腫脹大,微絨毛脫落,表膜破裂,出現(xiàn)破損。 結(jié)論:成功構(gòu)建和鑒定卡氏肺孢子主要表面糖蛋白UCS基因的siRNA表達載體;所構(gòu)建的PC MSG-UCS siRNA表達質(zhì)粒能在體外有效抑制PC中UCS基因的表達,導致PC細胞壁的破壞并殺滅PC;所構(gòu)建的PC MSG-UCS siRNA表達質(zhì)粒能在體內(nèi)有效抑制PC增長并殺滅PC,減輕肺部炎癥。
[Abstract]:Objective: the purpose of this study is to use RNA interference (RNA interference RNAi) technology, construction of Pneumocystis carinii (Pneumocystis carinii, PC) major surface glycoprotein (Major surface glycoprotein, MSG) expression of conserved sequences upstream regulatory genes (Upstream conserved sequence UCS RNA (siRNA) small interfering short expression vector, interfering RNA) and transfected into the effective expression of PC, to study its inhibitory effect on PC.
Methods: designed and synthesized according to PC gene MSG-UCS short hairpin (Short hairpin RNA, shRNA) sequence and cloned into siRNA pTZU6+1 expression vector and identified by enzyme digestion and sequencing; the construction of major surface glycoprotein UCS gene siRNA expression vector pPC-UCS was transfected into PC, with the expression of 48 RT-PCR hours after transfection was detected in the UCS gene, to observe the ultrastructural changes of PC in the scanning electron microscope; the expression vector of pPC-UCS water power injection to PCP rats after 48 hours, check the following: India Pianji number of rat lung cysts, observe the change of lung tissue pathology and ultrastructural changes of electron microscopy for detection of PC.
Results: the target gene product with consistent enzyme digestion and sequencing; reduce the level of UCSmRNA expression in vitro transfection of pPC-UCS PC, compared with the control group, there was significant difference between UCSmRNA, the inhibition rate was 77.47%; pPC-UCS48 hours after transfection, PC was observed in scanning electron microscopy, PC visible edema swell microvilli table, membrane rupture, breakage. In vivo transfection of pPC-UCS 48h after cyst reduction rate of 67.88%, compared with the control group, the results were significant differences; rat alveolar inflammation reduced, compared with the control group, there was significant difference between observed; scanning electron microscopy PC edema swell, microvilli membrane rupture, appear damaged.
Conclusion: siRNA and identification of Pneumocystis major surface glycoprotein UCS gene expression vector was successfully constructed; the constructed PC MSG-UCS expression plasmid siRNA can effectively inhibit the expression of PC UCS gene in vitro, cause PC cell wall damage and kill PC; the PC MSG-UCS siRNA expression plasmid could effectively inhibit the PC in vivo growth and kill PC, reduce the inflammation in the lungs.

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R531.5;R346

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