本文關(guān)鍵詞：RNAi沉默卡氏肺孢子MSG-UCS基因表達(dá)的研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 卡氏肺孢子蟲肺炎 卡氏肺孢子 MSG-UCS基因 siRNA

【摘要】： 目的:本研究旨在應(yīng)用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù),構(gòu)建卡氏肺孢子(Pneumocystis carinii,PC)主要表面糖蛋白(Major surface glycoprotein,MSG)表達(dá)調(diào)控基因上游保守序列(Upstream conserved sequence,UCS)的小干擾RNA(short interfering RNA,siRNA)表達(dá)載體,并將其轉(zhuǎn)染到PC中有效表達(dá)后,研究其對(duì)PC的抑制作用。 方法:設(shè)計(jì)并人工合成針對(duì)PC MSG-UCS基因的短發(fā)夾狀(Short hairpin RNA,shRNA)序列并定向克隆到siRNA表達(dá)載體pTZU6+1上,采用雙酶切與測(cè)序法進(jìn)行鑒定;將構(gòu)建成功的主要表面糖蛋白UCS基因siRNA表達(dá)載體pPC-UCS體外轉(zhuǎn)染到PC中,用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后UCS基因的表達(dá),在掃描電鏡下觀察PC的超微結(jié)構(gòu)變化;將表達(dá)載體pPC-UCS用水動(dòng)力法注射到PCP大鼠體內(nèi),48小時(shí)后進(jìn)行以下檢查:大鼠肺印片記數(shù)包囊、觀察肺組織病理改變、電鏡檢測(cè)PC的超微結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果:酶切和測(cè)序鑒定得到的產(chǎn)物與預(yù)期目的基因一致;體外轉(zhuǎn)染pPC-UCS的PC中UCSmRNA表達(dá)水平降低,與對(duì)照組相比,結(jié)果具有顯著性差異,UCSmRNA的抑制率為77.47%;轉(zhuǎn)染pPC-UCS48小時(shí)后,在掃描電鏡中觀察PC,可見PC水腫脹大,微絨毛脫落,表膜破裂,出現(xiàn)破損。體內(nèi)轉(zhuǎn)染pPC-UCS 48h后,包囊減少率為67.88%,與對(duì)照組相比,結(jié)果具有顯著性差異;大鼠肺泡炎減輕,與對(duì)照組相比,結(jié)果具有顯著性差異;掃描電鏡觀察可見PC水腫脹大,微絨毛脫落,表膜破裂,出現(xiàn)破損。 結(jié)論:成功構(gòu)建和鑒定卡氏肺孢子主要表面糖蛋白UCS基因的siRNA表達(dá)載體;所構(gòu)建的PC MSG-UCS siRNA表達(dá)質(zhì)粒能在體外有效抑制PC中UCS基因的表達(dá),導(dǎo)致PC細(xì)胞壁的破壞并殺滅PC;所構(gòu)建的PC MSG-UCS siRNA表達(dá)質(zhì)粒能在體內(nèi)有效抑制PC增長(zhǎng)并殺滅PC,減輕肺部炎癥。
[Abstract]:Objective: the purpose of this study is to use RNA interference (RNA interference RNAi) technology, construction of Pneumocystis carinii (Pneumocystis carinii, PC) major surface glycoprotein (Major surface glycoprotein, MSG) expression of conserved sequences upstream regulatory genes (Upstream conserved sequence UCS RNA (siRNA) small interfering short expression vector, interfering RNA) and transfected into the effective expression of PC, to study its inhibitory effect on PC.
Methods: designed and synthesized according to PC gene MSG-UCS short hairpin (Short hairpin RNA, shRNA) sequence and cloned into siRNA pTZU6+1 expression vector and identified by enzyme digestion and sequencing; the construction of major surface glycoprotein UCS gene siRNA expression vector pPC-UCS was transfected into PC, with the expression of 48 RT-PCR hours after transfection was detected in the UCS gene, to observe the ultrastructural changes of PC in the scanning electron microscope; the expression vector of pPC-UCS water power injection to PCP rats after 48 hours, check the following: India Pianji number of rat lung cysts, observe the change of lung tissue pathology and ultrastructural changes of electron microscopy for detection of PC.
Results: the target gene product with consistent enzyme digestion and sequencing; reduce the level of UCSmRNA expression in vitro transfection of pPC-UCS PC, compared with the control group, there was significant difference between UCSmRNA, the inhibition rate was 77.47%; pPC-UCS48 hours after transfection, PC was observed in scanning electron microscopy, PC visible edema swell microvilli table, membrane rupture, breakage. In vivo transfection of pPC-UCS 48h after cyst reduction rate of 67.88%, compared with the control group, the results were significant differences; rat alveolar inflammation reduced, compared with the control group, there was significant difference between observed; scanning electron microscopy PC edema swell, microvilli membrane rupture, appear damaged.
Conclusion: siRNA and identification of Pneumocystis major surface glycoprotein UCS gene expression vector was successfully constructed; the constructed PC MSG-UCS expression plasmid siRNA can effectively inhibit the expression of PC UCS gene in vitro, cause PC cell wall damage and kill PC; the PC MSG-UCS siRNA expression plasmid could effectively inhibit the PC in vivo growth and kill PC, reduce the inflammation in the lungs.

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R531.5;R346

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