本文關(guān)鍵詞：脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)骨誘導(dǎo)性及相關(guān)細胞鑒定的實驗研究　出處：《昆明醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的： 通過對DDM誘導(dǎo)成骨過程中各種細胞演變過程的觀察和對間充質(zhì)干細胞、成骨細胞和軟骨細胞的進行免疫組化鑒定,TRAP染色對破骨細胞進行觀察,探討DDM誘導(dǎo)成骨機制的細胞理論框架和成骨方式。 方法； 采用自身對照的研究方法在24只3月齡新西蘭大耳白兔雙側(cè)豎脊肌區(qū)制備標準一致的四個肌袋位點,隨機選取三個位點為實驗位點,植入DDM50mg (濕重,下同),另一位點為對照位點,空白對照,不植入任何材料。分別于術(shù)后1周、2周、3周、4周、8周、12周、16周和20周處死動物獲取組織標本,應(yīng)用HE染色、TRAP染色和免疫組織化學染色對間充質(zhì)干細胞、成骨細胞、軟骨細胞及破骨細胞的鑒定。采用Image-Pro(?) Plus6.0圖像分析軟件測量組織切片累積光密度值(IOD),對間充質(zhì)干細胞、成骨細胞、軟骨細胞進行分析。所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果： 1.大體觀察 術(shù)后所有動物完全蘇醒,精神狀態(tài)良好,活動自如,正常飲食；創(chuàng)口未見開裂,無紅腫、出血及滲出。術(shù)后第三天,創(chuàng)口已部分愈合,部分縫線被兔咬斷。 術(shù)后一周,術(shù)區(qū)毛發(fā)逐漸生長,部分已覆蓋愈合的創(chuàng)口,所有動物精神狀況良好,飲食、活動正常。 獲取組織標本時,隨時間的增加,可見DDM與肌肉組織緊密融合；所有標本均未見DDM周圍組織紅腫、化膿等現(xiàn)象。 2.組織學觀察 (1)HE染色 對照組中,見肌纖維并行排列,肌纖維之間有細胞核位于胞質(zhì)的周邊,呈梭形；第一周至二十周的組織切片中,肌肉組織中均未見有炎性細胞侵入。實驗1周組,見DDM與周圍組織貼附,部分可見貼附不緊密,有間隙；細胞呈環(huán)形包繞DDM周圍,可見肉芽組織、小血管、炎性細胞、梭形的成纖維細胞和多核巨細胞。2周組,細胞緊密貼附DDM,周圍組織細胞數(shù)量減少,可見嗜堿性細胞。3周組,DDM間組織可見條索狀形成,可見團狀淡藍色軟骨樣基質(zhì)、均質(zhì)紅染的軟骨樣基質(zhì)和呈立方狀的成骨樣細胞。4周組,DDM周圍可見均質(zhì)紅染的骨樣基質(zhì),立方狀的成骨樣細胞被覆基質(zhì)表面。8周組,DDM顆粒邊緣見重新礦化,呈紫藍色,邊緣可見吸收凹陷,細胞貼附；有骨樣基質(zhì)形成,表面有立方狀成骨樣細胞,外圍有嗜酸性細胞。12周組和16周組,DDM之間可見空泡狀脂肪細胞,團狀無孔均質(zhì)紅染骨樣組織,邊緣有立方狀成骨樣細胞被覆,血管出現(xiàn),其內(nèi)見雙凹狀紅細胞。20周組,DDM周圍組織中可見軟骨樣基質(zhì),成骨樣細胞被覆表面,DDM可見礦化區(qū),呈紫藍色,外周有一層成纖維細胞形成膜狀結(jié)構(gòu)。 (2)免疫組化染色和TRAP染色 1)CD44免疫組化染色 實驗組CD44陽性表達第一周可見在DDM周圍的組織中,并未緊貼DDM,然后逐漸靠近DDM,表達逐漸增強,至第四周達高峰,而第四周至第二十周,陽性表達逐漸減弱,說明間充質(zhì)干細胞由周圍組織逐漸向DDM聚集。方差分析：第一周與第二、三、四、八、十二周,第二周與第一、三、四、二十周,第三周與第一、二、四、八、十六、二十周,第四周與各時間點,第八周與第十六、二十周之間,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而對照組均無陽性表達。 2)ALP免疫組化染色(堿性磷酸酶免疫組化) 實驗組中ALP陽性表達部位靠近DDM,逐漸向外圍擴展。ALP表達的數(shù)量由第一周逐漸增強,至第四周達到峰值,而第四周后,陽性表達逐漸降低。說明成骨細胞開始由DDM邊緣開始,逐步向外圍生長成熟,第四周后成骨細胞的數(shù)量開始逐漸減少。方差分析：第一周與第三、四、八周,第二周與第三、四、十六、二十周,第三、四周與各時間點,第八周與第十六、二十周之間,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而對照組均無陽性表達。 3)Ⅱ膠原免疫組化染色 實驗組第一周可見DDM周圍有Ⅱ膠原陽性表達,并逐漸增多,第四周陽性表達略有減低,第八周時達到頂峰,此后略有減低,但未隨時間的增加而出現(xiàn)明顯減少；對照組無陽性表達。方差分析：第一周與其他各時間點之間,第二周與第八周,第四周與第八周,第八周與第二十周之間,兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而對照組均無陽性表達。 4) TRAP染色(抗酒石酸酸性磷酸酶染色) 陽性對照可見酶活性部位呈紅橙色,分布于胞質(zhì)內(nèi),細胞核為陰性�？瞻讓φ蘸蛯嶒灲M中均未見陽性表達,說明在本實驗觀察周期內(nèi)無破骨細胞生成。 結(jié)論： 1、DDM植入兔豎脊肌袋,在觀察周期內(nèi),無組織炎癥、免疫排異和壞死,表明DDM具有良好的組織相容性。 2、組織學觀察,DDM周圍出現(xiàn)軟骨樣基質(zhì)、骨樣基質(zhì)、軟骨樣細胞、成骨樣細胞,表明DDM異位誘導(dǎo)成骨的動物模型建立成功；同時表明DDM具有骨誘導(dǎo)性。 3、從實驗周期內(nèi)觀察,無論軟骨樣細胞Ⅱ型膠原表達的量還是維持時間,均比成骨樣細胞多和長,表明DDM異位誘導(dǎo)成骨方式主要是軟骨內(nèi)成骨,是否膜內(nèi)成骨尚需進一步研究。 4、在本實驗觀察周期內(nèi),TRAP染色顯示無破骨細胞出現(xiàn)或者生成。
[Abstract]:Objective:
Through the observation of various cell evolution processes during DDM induced osteogenesis and immunohistochemical identification of mesenchymal stem cells, osteoblasts and chondrocytes, TRAP staining was used to observe osteoclasts, and to explore the cellular theoretical framework and the way of osteogenesis of DDM induced osteogenesis.
Method錛，

本文編號：1366053