本文關(guān)鍵詞：CTLA-4胞外段與HBsAg融合DNA疫苗增強(qiáng)抗HBV免疫的研究　出處：《浙江大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題,HBV感染所致的慢性肝炎及其并發(fā)癥嚴(yán)重危害了人類健康。目前臨床上對(duì)慢性肝炎的治療主要是采用α干擾素和核苷類藥物進(jìn)行抗病毒治療,但它們清除HBV cccDNA的作用有限,因此急需新的治療策略。 HBV感染慢性化與機(jī)體抗HBV特異性免疫應(yīng)答的缺陷或低下有關(guān),有效打破慢性HBV感染的免疫耐受狀態(tài),誘導(dǎo)出多克隆、多特異性、應(yīng)答強(qiáng)的免疫應(yīng)答是慢性肝炎治療的關(guān)鍵之一。DNA疫苗能同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體體液和細(xì)胞免疫反應(yīng),因此作為治療性疫苗在慢性肝炎的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)研究中顯示出良好的應(yīng)用前景,但其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答在大動(dòng)物種系和人類中仍較弱,這主要是由于被注射入體內(nèi)的DNA只有很少部分被抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cells,APC)攝取,因此如何增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性,是目前急需解決的課題。將DNA疫苗編碼的抗原靶向引導(dǎo)至APC表面,可促進(jìn)APC對(duì)抗原的攝取、加工和遞呈,廣泛增強(qiáng)抗原特異性CD4~+Th應(yīng)答、CD8~+Tc應(yīng)答及抗體反應(yīng),從而放大了免疫應(yīng)答效應(yīng),是增強(qiáng)DNA疫苗免疫原性的有效策略之一。 表達(dá)于激活T細(xì)胞表面的共刺激分子受體—細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4)能特異性地結(jié)合APC表面的B7-1/B7—2分子,并且它與B7的親和力比CD28與B7的親和力高20～50倍左右。利用CTLA-4胞外段與B7分子結(jié)合的高親和力,能夠?qū)⑴c其融合表達(dá)的特異性抗原靶向至APC,促進(jìn)APC對(duì)抗原的攝取、加工和遞呈并激活A(yù)PC這一特點(diǎn),本課題構(gòu)建CTLA-4胞外段與乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B virussurface antigen,HBsAg)融合的真核表達(dá)重組質(zhì)粒作為抗HBV免疫的DNA疫苗,通過(guò)免疫正常BALB/c小鼠和HBV轉(zhuǎn)基因小鼠,研究該融合表達(dá)質(zhì)粒增強(qiáng)特異性抗HBV免疫功能,打破HBV免疫耐受的可能性;同時(shí),初步研究該融合表達(dá)質(zhì)粒增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的作用機(jī)制,探討它作為一種新型乙肝基因疫苗對(duì)HBV持續(xù)感染的治療作用和應(yīng)用前景,為該疫苗用于慢性乙型肝炎的防治提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 本研究分以下四部分。 第一部分CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 目的:構(gòu)建CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒,并在體外對(duì)其進(jìn)行鑒定,以用于后續(xù)DNA免疫的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。 方法:通過(guò)RT-PCR和PCR法分別獲得小鼠的CTLA-4胞外段和HBsAg基因,采用分子克隆基本技術(shù)將獲得的目的基因分別插入至分泌型質(zhì)粒pSecTagB中,獲得重組質(zhì)粒pCTLA和pS,再以pCTLA為骨架,采用分子克隆法將HBsAg基因插入pCTLA中的CTLA-4基因的3'端,從而得到融合表達(dá)質(zhì)粒pCTLA-S。全自動(dòng)序列分析儀驗(yàn)證序列正確后,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞Cos-7,分別用RT-PCR和放免法檢測(cè)目的基因mRNA和HBsAg的表達(dá)。 結(jié)果:測(cè)序分析結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pCTLA、pS和pCTLA-S中插入了正確的基因序列。RT-PCR法檢測(cè)pCTLA、pS和pCTLA-S轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞中均有特異性目的基因mRNA的表達(dá),放免法檢測(cè)表明pS和pCTLA-S轉(zhuǎn)染Cos-7的胞內(nèi)和胞外均有HBsAg的表達(dá)。 結(jié)論:成功構(gòu)建了CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒pCTLA-S及對(duì)照重組質(zhì)粒pCTLA和pS,并能在真核細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)。 第二部分CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒免疫增強(qiáng)小鼠抗HBsAg免疫應(yīng)答的研究 目的:研究CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒免疫增強(qiáng)小鼠抗HBsAg免疫應(yīng)答的特點(diǎn),探討該融合重組質(zhì)粒免疫用于抗HBV感染的治療的可行性。 方法:將重組質(zhì)粒pCTLA-S及對(duì)照重組質(zhì)粒pCTLA、pS和pSecTagB經(jīng)超純質(zhì)粒大量抽提后,常規(guī)肌肉免疫BALB/c小鼠后,采用ELISA法動(dòng)態(tài)檢測(cè)小鼠血清抗-HBs;在加強(qiáng)免疫4周后處死一半小鼠(4只),無(wú)菌取單個(gè)脾細(xì)胞,用MTT法檢測(cè)HBsAg特異性淋巴細(xì)胞增殖活性,LDH法檢測(cè)HBsAg特異性的CTL反應(yīng),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞中HBsAg特異性CD8~+T細(xì)胞;ELISA法檢測(cè)HBsAg特異性IgG亞類和培養(yǎng)脾細(xì)胞HBsAg特異性的IFN-γ和IL-4的分泌水平。 結(jié)果:動(dòng)態(tài)檢測(cè)小鼠血清抗-HBs結(jié)果表明,pCTLA-S免疫后,抗體在初次免疫2周后開(kāi)始上升,至免疫后8周達(dá)到高峰,此后緩慢下降,至免疫后16周仍有較高水平的抗體;pCTLA-S免疫組與未融合質(zhì)粒pS免疫組相比,其抗體出現(xiàn)的時(shí)間明顯提前,滴度亦顯著升高,pCTLA-S免疫組最高可達(dá)7123mIU/ml,而pS最高僅為261mIU/ml,升高達(dá)數(shù)百倍(pCTLA-S vs pS,P＜0.0001)。pCTLA-S免疫明顯增強(qiáng)了HBsAg特異性T細(xì)胞增殖(pCTLA-S vs pS,P＜0.01)和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞殺傷功能(pCTLA-S vs pS的CTL活性分別為:E/T=80,38.1±5.4%vs 25.4±3.7%,P＜0.05);融合表達(dá)質(zhì)粒pCTLA-S免疫較非融合的pS免疫能夠誘導(dǎo)出更多的HBsAg特異性的CD8~+T細(xì)胞分泌IFN-γ,促進(jìn)Tc1細(xì)胞增殖(pCTLA-S Vs pS:7.27±1.29%vs 2.76±0.6%,P＜0.01);對(duì)免疫球蛋白IgG亞類進(jìn)行分析和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4水平檢測(cè)表明,pCTLA-S與非融合質(zhì)粒pS免疫組相比,能同時(shí)增強(qiáng)HBsAg特異性IgG1和IgG2a的產(chǎn)生,增強(qiáng)抗原特異性的IFN-γ和IL-4的分泌(pCTLA-S vs pS,IFN-γ:369.7±117.8pg/ml vs 101.7±31.9pg/ml,IL-4:94.2±15.6pg/ml vs 42.0±10.2pg/ml,均P＜0.01)。 結(jié)論:pCTLA-S不僅顯著增強(qiáng)小鼠抗HBsAg的特異性抗體免疫應(yīng)答,而且顯著增強(qiáng)HBsAg特異性T細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞殺傷功能,有效誘導(dǎo)HBsAg特異性的CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ,促進(jìn)Tc1細(xì)胞增殖,顯著增強(qiáng)了HBsAg特異性的Th免疫應(yīng)答,預(yù)示著該融合質(zhì)粒免疫可能在抗HBV感染治療中具有潛在的應(yīng)用前景。 第三部分CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒免疫在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中的抗病毒效應(yīng)及其誘導(dǎo)的抗HBsAg免疫應(yīng)答的研究 目的:觀察融合重組表達(dá)質(zhì)粒pCTLA-S免疫對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg小鼠)中HBV的免疫清除作用,并對(duì)其在HBV轉(zhuǎn)基因鼠中的免疫應(yīng)答進(jìn)行研究,探討pCTLA-S免疫對(duì)HBV持續(xù)感染的治療作用和應(yīng)用前景。 方法:重組質(zhì)粒pCTLA-S及對(duì)照重組質(zhì)粒pS和pSecTagB經(jīng)超純質(zhì)粒大量抽提后,常規(guī)肌肉免疫Tg小鼠后,分別采用放免法(RIA)和ELISA法動(dòng)態(tài)檢測(cè)血清HBsAg和抗-HBs水平,熒光定量PCR法檢測(cè)血清HBV DNA滴度;在加強(qiáng)免疫4周后處死一半小鼠,無(wú)菌取單個(gè)脾細(xì)胞,用MTT法檢測(cè)HBsAg特異性淋巴細(xì)胞增殖活性,LDH法檢測(cè)HBsAg特異性的CTL反應(yīng),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞中HBsAg特異性CD8~+T細(xì)胞,ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)脾細(xì)胞HBsAg特異性的IFN-γ和IL-4的分泌水平;常規(guī)化學(xué)比色法檢測(cè)血清ALT水平;病理切片常規(guī)HE染色及免疫組化分析肝臟組織學(xué)及HBsAg表達(dá)。 結(jié)果:融合質(zhì)粒pCTLA-S免疫組有效下調(diào)血清HBV DNA和HBsAg水平,且與pS組相比,其下調(diào)作用更迅速、更明顯,尤其在免疫后8、12、16周,其下調(diào)作用自初次免疫后2周開(kāi)始,以后逐漸增強(qiáng),于免疫后8周下調(diào)效果十分明顯(其中實(shí)驗(yàn)組中有1只測(cè)不到HBV DNA,即＜1×10~3 copies/ml),以后維持在較低水平,直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束,在實(shí)驗(yàn)的16周內(nèi)沒(méi)有任何反彈(16周時(shí),HBVDNA滴度的對(duì)數(shù)pCTLA-S vs pS:3.58±0.09 vs 4.46±0.18,P＜0.05;HBsAg抑制率pCTLA-S vs pS為:33.2±4.6%vs 17.04±2.76%,p＜0.01)。研究該融合質(zhì)粒免疫后Tg小鼠中的免疫應(yīng)答特點(diǎn)表明,融合表達(dá)重組質(zhì)粒pCTLA-S免疫能有效誘導(dǎo)Tg小鼠產(chǎn)生抗-HBs應(yīng)答,與pS相比,其出現(xiàn)的時(shí)間提早,滴度也明顯升高,于8周達(dá)到高峰(6～16周,pCTLA-S vs pS均p＜0.001);pCTLA-S免疫能有效誘導(dǎo)Tg小鼠產(chǎn)生抗原特異性的CTL應(yīng)答,當(dāng)效靶細(xì)胞比在80:1時(shí),其CTL應(yīng)答與pS免疫組相比具有顯著差異(26.1±4.6%vs 16.1±3.8%,p＜0.05);與非融合質(zhì)粒pS免疫相比,pCTLA-S免疫能顯著增強(qiáng)淋巴細(xì)胞抗原增殖活性(SI:3.6±0.49 vs 2.3±0.51,p＜0.01),同時(shí)促進(jìn)脾細(xì)胞HBsAg特異性IFN-γ和IL-4的產(chǎn)生,其中pCTLA-S免疫組釋放的IFN-γ是pS組的3倍,而IL-4為pS組的2倍多(均P＜0.05);流式細(xì)胞術(shù)分析抗原特異性的CD8~+T細(xì)胞表明,pCTLA-S免疫能夠誘導(dǎo)出更多的HBsAg特異性的CD8~+T細(xì)胞分泌IFN-γ,大約是pS免疫組的3倍(P＜0.01);小鼠血清ALT的動(dòng)態(tài)檢測(cè)表明,重組質(zhì)粒pCTLA-S和pS免疫后有僅個(gè)別小鼠ALT有輕度增高,但與空載體pSecTagB免疫組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);肝臟免疫組化結(jié)果表明,空載體pSecTagB免疫后Tg鼠肝組織HBsAg表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性,pCTLA-S免疫組有3例(3/8)HBsAg表達(dá)明顯減弱,而pS組HBsAg表達(dá)有1例(1/8)HBsAg表達(dá)明顯減弱。 結(jié)論:在HBV-Tg小鼠中,融合重組表達(dá)質(zhì)粒pCTLA-S免疫比非融合的pS免疫能誘導(dǎo)出更強(qiáng)的HBsAg特異性的抗體應(yīng)答;增強(qiáng)HBsAg特異性的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞殺傷功能,有效誘導(dǎo)HBsAg特異性的CD8~+T細(xì)胞分泌IFN-γ,促進(jìn)Tc1細(xì)胞增殖,增強(qiáng)Th應(yīng)答,對(duì)HBV-Tg小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平有明顯的抑制作用。 第四部分CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒免疫增強(qiáng)抗HBV免疫應(yīng)答機(jī)制的初步研究 目的:構(gòu)建一個(gè)含突變的CTLA-4胞外段與HBsAg融合的重組表達(dá)質(zhì)粒pmCTLA-S,該突變是將CTLA-4胞外區(qū)的MYPPPY基序中的104位酪氨酸殘基的密碼子突變?yōu)楸彼崦艽a子。通過(guò)免疫正常和轉(zhuǎn)基因小鼠,觀察pmCTLA-S的免疫應(yīng)答特點(diǎn)和抗病毒作用,初步研究融合表達(dá)質(zhì)粒pCTLA-S抗HBV免疫增強(qiáng)機(jī)理。 方法:用PCR法擴(kuò)增突變的CTLA-4胞外段,采用分子克隆基本技術(shù)將獲得的突變的CTLA-4胞外段插入至切除CTLA-4胞外段的pCTLA-S質(zhì)粒中,構(gòu)建得到含突變的CTLA-4胞外段的融合質(zhì)粒pmCTLA-S。全自動(dòng)序列分析儀驗(yàn)證pmCTLA-S序列正確后,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞Cos-7,放免法(RIA)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞HBsAg的表達(dá),用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)上清中融合表達(dá)蛋白mCTLA-S中突變的CTLA-4與B7結(jié)合力,將突變的pmCTLA-S質(zhì)粒分別免疫BALB/c和HBV-Tg小鼠,采用ELISA、MTT和LDH等方法檢測(cè)pmCTLA-S免疫對(duì)小鼠抗HBsAg特異性抗體應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響;分別用熒光定量PCR和RIA檢測(cè)pmCTLA-S免疫對(duì)小鼠血清HBV DNA滴度和HBsAg的表達(dá)水平的影響。 結(jié)果:測(cè)序結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pmCTLA-S中插入的突變的CTLA-4胞外段基因序列完全正確;放免法檢測(cè)表明pmCTLA-S的目的基因在Cos-7細(xì)胞有效表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明,pmCTLA-S表達(dá)的突變CTLA-4與B7結(jié)合力較未突變pCTLA-S明顯下降,結(jié)合力約為未突變CTLA-4的1/4(平均熒光強(qiáng)度MIF:12.3vs 3.06)。研究pmCTLA-S誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答表明,pmCTLA-S免疫誘導(dǎo)的小鼠抗-HBs比未突變pCTLA-S顯著降低(各周抗體滴度pmCTLA-S vs pCTLA-S,均p＜0.001),且與pS所誘導(dǎo)的抗體滴度無(wú)顯著性差異(各周抗體滴度pmCTLA-S vs pS,均p＞0.05);pmCTLA-S免疫后小鼠的無(wú)論是細(xì)胞增殖活性還是CTL應(yīng)答與pS免疫組相比并未見(jiàn)有意義的升高(均p＞0.05),與pCTLA-S免疫組相比細(xì)胞增殖活性和CTL活性均明顯下降(pmCTLA-S vs pCTLA-S,SI:2.54±0.75 vs 4.05±0.47,P＜0.01;CTL活性:E/T=40,17.5±3.2%vs 27.0±2.8%,p＜0.05);進(jìn)一步檢測(cè)pmCTLA-S免疫對(duì)HBV Tg小鼠血清HBV DNA和HBsAg的影響,發(fā)現(xiàn)pmCTLA-S免疫對(duì)Tg小鼠血清HBV DNA和HBsAg表達(dá)均有一定的抑制作用,其抑制效應(yīng)與pS基本一致(均P＞0.05),但與pCTLA-S免疫相比抑制效應(yīng)明顯下降,尤其在免疫后8周兩組差異最為顯著(pmCTLA-S vs pCTLA-S:HBsAg抑制率為17.05±5.75%vs 30.5±4.38%,p＜0.01)。 結(jié)論:CTLA-4與B7的有效結(jié)合是融合重組質(zhì)粒pCTLA-S疫苗增強(qiáng)抗HBV免疫和控制HBV病毒復(fù)制與表達(dá)所必需的,在體外通過(guò)基因工程等方法提高CTLA-4胞外段與B7的親和力有助于增強(qiáng)CTLA-4融合表達(dá)DNA疫苗的的免疫原性,是CTLA-4融合基因疫苗改良的有效途徑之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1365299