本文關(guān)鍵詞：CTLA-4胞外段與HBsAg融合DNA疫苗增強抗HBV免疫的研究　出處：《浙江大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是世界性的公共衛(wèi)生問題,HBV感染所致的慢性肝炎及其并發(fā)癥嚴重危害了人類健康。目前臨床上對慢性肝炎的治療主要是采用α干擾素和核苷類藥物進行抗病毒治療,但它們清除HBV cccDNA的作用有限,因此急需新的治療策略。 HBV感染慢性化與機體抗HBV特異性免疫應(yīng)答的缺陷或低下有關(guān),有效打破慢性HBV感染的免疫耐受狀態(tài),誘導(dǎo)出多克隆、多特異性、應(yīng)答強的免疫應(yīng)答是慢性肝炎治療的關(guān)鍵之一。DNA疫苗能同時誘導(dǎo)機體體液和細胞免疫反應(yīng),因此作為治療性疫苗在慢性肝炎的動物和臨床試驗研究中顯示出良好的應(yīng)用前景,但其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答在大動物種系和人類中仍較弱,這主要是由于被注射入體內(nèi)的DNA只有很少部分被抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells,APC)攝取,因此如何增強DNA疫苗的免疫原性,是目前急需解決的課題。將DNA疫苗編碼的抗原靶向引導(dǎo)至APC表面,可促進APC對抗原的攝取、加工和遞呈,廣泛增強抗原特異性CD4~+Th應(yīng)答、CD8~+Tc應(yīng)答及抗體反應(yīng),從而放大了免疫應(yīng)答效應(yīng),是增強DNA疫苗免疫原性的有效策略之一。 表達于激活T細胞表面的共刺激分子受體—細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4)能特異性地結(jié)合APC表面的B7-1/B7—2分子,并且它與B7的親和力比CD28與B7的親和力高20～50倍左右。利用CTLA-4胞外段與B7分子結(jié)合的高親和力,能夠?qū)⑴c其融合表達的特異性抗原靶向至APC,促進APC對抗原的攝取、加工和遞呈并激活A(yù)PC這一特點,本課題構(gòu)建CTLA-4胞外段與乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B virussurface antigen,HBsAg)融合的真核表達重組質(zhì)粒作為抗HBV免疫的DNA疫苗,通過免疫正常BALB/c小鼠和HBV轉(zhuǎn)基因小鼠,研究該融合表達質(zhì)粒增強特異性抗HBV免疫功能,打破HBV免疫耐受的可能性;同時,初步研究該融合表達質(zhì)粒增強機體免疫應(yīng)答的作用機制,探討它作為一種新型乙肝基因疫苗對HBV持續(xù)感染的治療作用和應(yīng)用前景,為該疫苗用于慢性乙型肝炎的防治提供實驗和理論依據(jù)。 本研究分以下四部分。 第一部分CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 目的:構(gòu)建CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達重組質(zhì)粒,并在體外對其進行鑒定,以用于后續(xù)DNA免疫的動物實驗研究。 方法:通過RT-PCR和PCR法分別獲得小鼠的CTLA-4胞外段和HBsAg基因,采用分子克隆基本技術(shù)將獲得的目的基因分別插入至分泌型質(zhì)粒pSecTagB中,獲得重組質(zhì)粒pCTLA和pS,再以pCTLA為骨架,采用分子克隆法將HBsAg基因插入pCTLA中的CTLA-4基因的3'端,從而得到融合表達質(zhì)粒pCTLA-S。全自動序列分析儀驗證序列正確后,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至真核細胞Cos-7,分別用RT-PCR和放免法檢測目的基因mRNA和HBsAg的表達。 結(jié)果:測序分析結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pCTLA、pS和pCTLA-S中插入了正確的基因序列。RT-PCR法檢測pCTLA、pS和pCTLA-S轉(zhuǎn)染的Cos-7細胞中均有特異性目的基因mRNA的表達,放免法檢測表明pS和pCTLA-S轉(zhuǎn)染Cos-7的胞內(nèi)和胞外均有HBsAg的表達。 結(jié)論:成功構(gòu)建了CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達重組質(zhì)粒pCTLA-S及對照重組質(zhì)粒pCTLA和pS,并能在真核細胞內(nèi)有效表達。 第二部分CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達重組質(zhì)粒免疫增強小鼠抗HBsAg免疫應(yīng)答的研究 目的:研究CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達重組質(zhì)粒免疫增強小鼠抗HBsAg免疫應(yīng)答的特點,探討該融合重組質(zhì)粒免疫用于抗HBV感染的治療的可行性。 方法:將重組質(zhì)粒pCTLA-S及對照重組質(zhì)粒pCTLA、pS和pSecTagB經(jīng)超純質(zhì)粒大量抽提后,常規(guī)肌肉免疫BALB/c小鼠后,采用ELISA法動態(tài)檢測小鼠血清抗-HBs;在加強免疫4周后處死一半小鼠(4只),無菌取單個脾細胞,用MTT法檢測HBsAg特異性淋巴細胞增殖活性,LDH法檢測HBsAg特異性的CTL反應(yīng),流式細胞術(shù)檢測脾細胞中HBsAg特異性CD8~+T細胞;ELISA法檢測HBsAg特異性IgG亞類和培養(yǎng)脾細胞HBsAg特異性的IFN-γ和IL-4的分泌水平。 結(jié)果:動態(tài)檢測小鼠血清抗-HBs結(jié)果表明,pCTLA-S免疫后,抗體在初次免疫2周后開始上升,至免疫后8周達到高峰,此后緩慢下降,至免疫后16周仍有較高水平的抗體;pCTLA-S免疫組與未融合質(zhì)粒pS免疫組相比,其抗體出現(xiàn)的時間明顯提前,滴度亦顯著升高,pCTLA-S免疫組最高可達7123mIU/ml,而pS最高僅為261mIU/ml,升高達數(shù)百倍(pCTLA-S vs pS,P＜0.0001)。pCTLA-S免疫明顯增強了HBsAg特異性T細胞增殖(pCTLA-S vs pS,P＜0.01)和細胞毒T淋巴細胞殺傷功能(pCTLA-S vs pS的CTL活性分別為:E/T=80,38.1±5.4%vs 25.4±3.7%,P＜0.05);融合表達質(zhì)粒pCTLA-S免疫較非融合的pS免疫能夠誘導(dǎo)出更多的HBsAg特異性的CD8~+T細胞分泌IFN-γ,促進Tc1細胞增殖(pCTLA-S Vs pS:7.27±1.29%vs 2.76±0.6%,P＜0.01);對免疫球蛋白IgG亞類進行分析和脾細胞培養(yǎng)上清細胞因子IFN-γ和IL-4水平檢測表明,pCTLA-S與非融合質(zhì)粒pS免疫組相比,能同時增強HBsAg特異性IgG1和IgG2a的產(chǎn)生,增強抗原特異性的IFN-γ和IL-4的分泌(pCTLA-S vs pS,IFN-γ:369.7±117.8pg/ml vs 101.7±31.9pg/ml,IL-4:94.2±15.6pg/ml vs 42.0±10.2pg/ml,均P＜0.01)。 結(jié)論:pCTLA-S不僅顯著增強小鼠抗HBsAg的特異性抗體免疫應(yīng)答,而且顯著增強HBsAg特異性T細胞增殖和細胞毒T淋巴細胞殺傷功能,有效誘導(dǎo)HBsAg特異性的CD8+T細胞分泌IFN-γ,促進Tc1細胞增殖,顯著增強了HBsAg特異性的Th免疫應(yīng)答,預(yù)示著該融合質(zhì)粒免疫可能在抗HBV感染治療中具有潛在的應(yīng)用前景。 第三部分CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達重組質(zhì)粒免疫在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中的抗病毒效應(yīng)及其誘導(dǎo)的抗HBsAg免疫應(yīng)答的研究 目的:觀察融合重組表達質(zhì)粒pCTLA-S免疫對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg小鼠)中HBV的免疫清除作用,并對其在HBV轉(zhuǎn)基因鼠中的免疫應(yīng)答進行研究,探討pCTLA-S免疫對HBV持續(xù)感染的治療作用和應(yīng)用前景。 方法:重組質(zhì)粒pCTLA-S及對照重組質(zhì)粒pS和pSecTagB經(jīng)超純質(zhì)粒大量抽提后,常規(guī)肌肉免疫Tg小鼠后,分別采用放免法(RIA)和ELISA法動態(tài)檢測血清HBsAg和抗-HBs水平,熒光定量PCR法檢測血清HBV DNA滴度;在加強免疫4周后處死一半小鼠,無菌取單個脾細胞,用MTT法檢測HBsAg特異性淋巴細胞增殖活性,LDH法檢測HBsAg特異性的CTL反應(yīng),流式細胞術(shù)檢測脾細胞中HBsAg特異性CD8~+T細胞,ELISA法檢測培養(yǎng)脾細胞HBsAg特異性的IFN-γ和IL-4的分泌水平;常規(guī)化學(xué)比色法檢測血清ALT水平;病理切片常規(guī)HE染色及免疫組化分析肝臟組織學(xué)及HBsAg表達。 結(jié)果:融合質(zhì)粒pCTLA-S免疫組有效下調(diào)血清HBV DNA和HBsAg水平,且與pS組相比,其下調(diào)作用更迅速、更明顯,尤其在免疫后8、12、16周,其下調(diào)作用自初次免疫后2周開始,以后逐漸增強,于免疫后8周下調(diào)效果十分明顯(其中實驗組中有1只測不到HBV DNA,即＜1×10~3 copies/ml),以后維持在較低水平,直到實驗結(jié)束,在實驗的16周內(nèi)沒有任何反彈(16周時,HBVDNA滴度的對數(shù)pCTLA-S vs pS:3.58±0.09 vs 4.46±0.18,P＜0.05;HBsAg抑制率pCTLA-S vs pS為:33.2±4.6%vs 17.04±2.76%,p＜0.01)。研究該融合質(zhì)粒免疫后Tg小鼠中的免疫應(yīng)答特點表明,融合表達重組質(zhì)粒pCTLA-S免疫能有效誘導(dǎo)Tg小鼠產(chǎn)生抗-HBs應(yīng)答,與pS相比,其出現(xiàn)的時間提早,滴度也明顯升高,于8周達到高峰(6～16周,pCTLA-S vs pS均p＜0.001);pCTLA-S免疫能有效誘導(dǎo)Tg小鼠產(chǎn)生抗原特異性的CTL應(yīng)答,當(dāng)效靶細胞比在80:1時,其CTL應(yīng)答與pS免疫組相比具有顯著差異(26.1±4.6%vs 16.1±3.8%,p＜0.05);與非融合質(zhì)粒pS免疫相比,pCTLA-S免疫能顯著增強淋巴細胞抗原增殖活性(SI:3.6±0.49 vs 2.3±0.51,p＜0.01),同時促進脾細胞HBsAg特異性IFN-γ和IL-4的產(chǎn)生,其中pCTLA-S免疫組釋放的IFN-γ是pS組的3倍,而IL-4為pS組的2倍多(均P＜0.05);流式細胞術(shù)分析抗原特異性的CD8~+T細胞表明,pCTLA-S免疫能夠誘導(dǎo)出更多的HBsAg特異性的CD8~+T細胞分泌IFN-γ,大約是pS免疫組的3倍(P＜0.01);小鼠血清ALT的動態(tài)檢測表明,重組質(zhì)粒pCTLA-S和pS免疫后有僅個別小鼠ALT有輕度增高,但與空載體pSecTagB免疫組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);肝臟免疫組化結(jié)果表明,空載體pSecTagB免疫后Tg鼠肝組織HBsAg表達強陽性,pCTLA-S免疫組有3例(3/8)HBsAg表達明顯減弱,而pS組HBsAg表達有1例(1/8)HBsAg表達明顯減弱。 結(jié)論:在HBV-Tg小鼠中,融合重組表達質(zhì)粒pCTLA-S免疫比非融合的pS免疫能誘導(dǎo)出更強的HBsAg特異性的抗體應(yīng)答;增強HBsAg特異性的淋巴細胞增殖反應(yīng)、細胞毒T淋巴細胞殺傷功能,有效誘導(dǎo)HBsAg特異性的CD8~+T細胞分泌IFN-γ,促進Tc1細胞增殖,增強Th應(yīng)答,對HBV-Tg小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平有明顯的抑制作用。 第四部分CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達重組質(zhì)粒免疫增強抗HBV免疫應(yīng)答機制的初步研究 目的:構(gòu)建一個含突變的CTLA-4胞外段與HBsAg融合的重組表達質(zhì)粒pmCTLA-S,該突變是將CTLA-4胞外區(qū)的MYPPPY基序中的104位酪氨酸殘基的密碼子突變?yōu)楸彼崦艽a子。通過免疫正常和轉(zhuǎn)基因小鼠,觀察pmCTLA-S的免疫應(yīng)答特點和抗病毒作用,初步研究融合表達質(zhì)粒pCTLA-S抗HBV免疫增強機理。 方法:用PCR法擴增突變的CTLA-4胞外段,采用分子克隆基本技術(shù)將獲得的突變的CTLA-4胞外段插入至切除CTLA-4胞外段的pCTLA-S質(zhì)粒中,構(gòu)建得到含突變的CTLA-4胞外段的融合質(zhì)粒pmCTLA-S。全自動序列分析儀驗證pmCTLA-S序列正確后,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染真核細胞Cos-7,放免法(RIA)檢測轉(zhuǎn)染細胞HBsAg的表達,用流式細胞術(shù)檢測培養(yǎng)上清中融合表達蛋白mCTLA-S中突變的CTLA-4與B7結(jié)合力,將突變的pmCTLA-S質(zhì)粒分別免疫BALB/c和HBV-Tg小鼠,采用ELISA、MTT和LDH等方法檢測pmCTLA-S免疫對小鼠抗HBsAg特異性抗體應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答的影響;分別用熒光定量PCR和RIA檢測pmCTLA-S免疫對小鼠血清HBV DNA滴度和HBsAg的表達水平的影響。 結(jié)果:測序結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pmCTLA-S中插入的突變的CTLA-4胞外段基因序列完全正確;放免法檢測表明pmCTLA-S的目的基因在Cos-7細胞有效表達。流式細胞術(shù)檢測表明,pmCTLA-S表達的突變CTLA-4與B7結(jié)合力較未突變pCTLA-S明顯下降,結(jié)合力約為未突變CTLA-4的1/4(平均熒光強度MIF:12.3vs 3.06)。研究pmCTLA-S誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答表明,pmCTLA-S免疫誘導(dǎo)的小鼠抗-HBs比未突變pCTLA-S顯著降低(各周抗體滴度pmCTLA-S vs pCTLA-S,均p＜0.001),且與pS所誘導(dǎo)的抗體滴度無顯著性差異(各周抗體滴度pmCTLA-S vs pS,均p＞0.05);pmCTLA-S免疫后小鼠的無論是細胞增殖活性還是CTL應(yīng)答與pS免疫組相比并未見有意義的升高(均p＞0.05),與pCTLA-S免疫組相比細胞增殖活性和CTL活性均明顯下降(pmCTLA-S vs pCTLA-S,SI:2.54±0.75 vs 4.05±0.47,P＜0.01;CTL活性:E/T=40,17.5±3.2%vs 27.0±2.8%,p＜0.05);進一步檢測pmCTLA-S免疫對HBV Tg小鼠血清HBV DNA和HBsAg的影響,發(fā)現(xiàn)pmCTLA-S免疫對Tg小鼠血清HBV DNA和HBsAg表達均有一定的抑制作用,其抑制效應(yīng)與pS基本一致(均P＞0.05),但與pCTLA-S免疫相比抑制效應(yīng)明顯下降,尤其在免疫后8周兩組差異最為顯著(pmCTLA-S vs pCTLA-S:HBsAg抑制率為17.05±5.75%vs 30.5±4.38%,p＜0.01)。 結(jié)論:CTLA-4與B7的有效結(jié)合是融合重組質(zhì)粒pCTLA-S疫苗增強抗HBV免疫和控制HBV病毒復(fù)制與表達所必需的,在體外通過基因工程等方法提高CTLA-4胞外段與B7的親和力有助于增強CTLA-4融合表達DNA疫苗的的免疫原性,是CTLA-4融合基因疫苗改良的有效途徑之一。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1365299