本文關(guān)鍵詞：P-選擇素靶向微泡造影劑評價小鼠下肢缺血—再灌注損傷及實(shí)驗(yàn)用動物血栓模型的制備　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 背景1:缺血一再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,I-R)是一種常見的病理生理現(xiàn)象,可見于冠心病、心肌梗塞、腦梗塞等多種心腦血管疾病。在I-R時伴隨著血管內(nèi)皮炎癥的發(fā)生和發(fā)展,在血管內(nèi)皮炎癥的發(fā)生過程中,包含著大量炎癥介質(zhì)與粘附分子的分泌。大量研究表明,急性炎癥時,P-選擇素分泌表達(dá)增加,如果我們能夠采用無創(chuàng)的影像學(xué)方法判斷這些粘附分子的變化,無疑將會具有極其重要的臨床價值。 靶向超聲分子成像(targeted ultrasound molecular imaging)是目前國際上影像學(xué)技術(shù)領(lǐng)域正在探討的前沿?zé)狳c(diǎn),它是依靠微泡表面固有的特性或通過對微泡進(jìn)行特殊處理,使微泡能滯留在特殊的組織和器官的一種新技術(shù)。靶向超聲分子成像有可能在以下兩方面拓展傳統(tǒng)超聲微泡技術(shù)的應(yīng)用范圍,其一是發(fā)展一種無創(chuàng)性評價各種病變組織和器官的分子學(xué)圖像,如血管內(nèi)皮損傷、血栓形成、血管新生和腫瘤等;其二是可能為基因和藥物的定向釋放提供新的技術(shù)支持。近年來,國外已成功地應(yīng)用攜帶P-選擇素單抗的微泡造影劑評價心臟、腎臟I-R損傷,顯示了靶向超聲分子成像評價炎癥反應(yīng)的良好前景。然而,國內(nèi)的靶向分子成像技術(shù)的研究尚無實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。 外周血管動脈粥樣硬化是冠心病的等危癥,可導(dǎo)致跛行、壞疽等并發(fā)癥,并可導(dǎo)致肢體I-R損傷。隨著外周動脈粥樣硬化性疾病發(fā)病率的增加,早期發(fā)現(xiàn)下肢I(xiàn)-R損傷對減少上述并發(fā)癥有著重要的意義,故一種無創(chuàng)的早期檢查骨骼肌I-R損傷的方法是十分重要的。目前應(yīng)用靶向超聲分子顯像技術(shù)對心肌、腎臟I-R損傷評價的研究較多,而下肢的局部血流量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于心臟及腎臟,炎癥靶向微泡造影劑是否能評價肢體骨骼肌的I-R損傷尚不十分清楚,國內(nèi)并無相關(guān)文獻(xiàn)報道。因此,本研究在普通脂質(zhì)微泡的基礎(chǔ)上,通過“抗生物素蛋白/生物素復(fù)合體”(Avidin-biotin)的化學(xué)橋接作用(bridging chemistry)將抗小鼠P-選擇素單克隆抗體連接于脂質(zhì)微泡外殼構(gòu)建了攜帶抗P-選擇素單抗靶向微泡(MBp),在建立小鼠下肢骨骼肌I-R損傷模型后,應(yīng)用MBp和普通脂質(zhì)微泡(無攜帶抗P-選擇素單抗的脂質(zhì)微泡,MB)行對比超聲檢查,目的在于探討MBp結(jié)合CEU早期評價小鼠下肢I(xiàn)-R損傷的可行性。 背景2:血栓性疾病近年來發(fā)病率較前明顯增加,國內(nèi)統(tǒng)計,自2001年來,腦梗塞、冠心病、心肌梗死一直在疾病死亡排位中位居前4位,據(jù)世界衛(wèi)生組織2002年的統(tǒng)計,每年大約有1700萬人死于各種心腦血管疾病。血栓形成或栓塞是導(dǎo)致心腦和外周血管事件的最后關(guān)鍵環(huán)節(jié),是致死和致殘的直接原因,沒有血栓就沒有事件。故血栓性疾病的早期診斷與治療對減少死亡率及改善預(yù)后是極其重要的一環(huán),但目前的一些檢查方法如CT、MRI等均存在著一些缺陷。 超聲開始只是作為一種對血栓性疾病的診斷方法,但近年來,人們發(fā)現(xiàn),超聲也有溶栓的作用。隨著靶向微泡造影劑的出現(xiàn),超聲結(jié)合微泡在血栓性疾病的診斷和治療中的作用正越來越得到人們的重視。目前超聲結(jié)合微泡溶栓治療多還處于基礎(chǔ)研究及動物實(shí)驗(yàn)階段,然而,既往的一些制備動物微循環(huán)血栓模型的方法較復(fù)雜,不易成功,且血管完全閉塞,不能滿足血栓靶向微泡微循環(huán)實(shí)驗(yàn)的要求。本研究采用靜脈注射不同劑量的光敏劑制備大鼠提睪肌微循環(huán)血栓模型,使其能用于評價溶栓效果及血栓靶向微泡的微循環(huán)實(shí)驗(yàn)。 目的:第一部分:探討自制的P-選擇素靶向微泡結(jié)合對比超聲在小鼠骨骼肌早期I-R中的診斷價值。 第二部分:通過光化學(xué)法建立一種新的和臨床病理機(jī)制相似的大鼠提睪肌微循環(huán)血栓模型,可用于血栓靶向微泡造影劑的微循環(huán)實(shí)驗(yàn)。 方法:第一部分:各種相關(guān)脂質(zhì)材料按一定質(zhì)量比例75℃水浴溶解于適量蒸餾水中,同時通全氟丙烷(C_3F_8)氣體,超聲振蕩至形成乳白色液體制備普通脂質(zhì)微泡或生物素(biotin)化脂質(zhì)微泡。生物素化脂質(zhì)微泡經(jīng)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合脂質(zhì)純化4次后,按一定比例加入抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)。繼續(xù)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合抗生蛋白鏈菌素純化微泡2次后,按一定比例加入生物素化的抗小鼠P-選擇素單克隆抗體(biotinconjugated rat anti-mouse P-selectin monoclone antibody),最后靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合抗體純化微泡2次,冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩２捎脦鞝柼赜嫈?shù)儀測量靶向微泡的平均粒徑及濃度。采用綠色熒光標(biāo)記的二抗與抗P-選擇素單抗結(jié)合,熒光顯微鏡下觀察抗P-選擇素單抗與微泡的連接情況。 將小鼠用水和氯醛(0.6ml/100g)麻醉后,穿刺尾靜脈后留置套管針,鈍性分離出股動脈,用動脈夾將其夾閉,1小時后松開。再灌注1小時后,對所有實(shí)驗(yàn)小鼠行MB和MBp的下肢對比超聲檢查。CEU采用經(jīng)靜脈微泡彈丸式注射法進(jìn)行,每只小鼠采用微量進(jìn)樣器經(jīng)尾靜脈隨機(jī)(間隔30min)注射普通脂質(zhì)微泡和靶向微泡數(shù)量均為約5×10~6個。經(jīng)過10min循環(huán)時間待血池中循環(huán)微泡完全消失后對下肢骨骼肌進(jìn)行CEU檢查,獲取實(shí)驗(yàn)小鼠缺血再灌注骨骼肌及正常骨骼肌顯影圖像,全部聲學(xué)造影圖像存于MO盤,以備脫機(jī)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠,取兩側(cè)下肢骨骼肌,10%甲醛固定,行病理學(xué)檢查。采用CEU軟件分析靶向?qū)Ρ瘸晥D像,制作彩色編碼圖應(yīng)用CEU軟件對圖像進(jìn)行分析,評價實(shí)驗(yàn)小鼠下肢骨骼肌顯影的聲強(qiáng)度(video intensity,Ⅵ),第一幀CEU圖像的Ⅵ值代表微泡在骨骼肌組織的滯留濃度,采用彩色編碼技術(shù)制作骨骼肌顯影的彩色編碼圖像。使用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均以(?)±s表示,兩組數(shù)據(jù)間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。差異性檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為P＜0.05(雙側(cè))。 第二部分:將15只SD雄性大鼠隨機(jī)分為5組,將大鼠以13.3%烏拉坦+1%氯醛糖溶液(0.6ml/100g)臀部肌肉注射麻醉。分離一側(cè)股靜脈,插入連接有三通的聚乙烯導(dǎo)管(PE50,內(nèi)徑0.58mm)。將大鼠右側(cè)陰囊皮膚剪開,剝離睪丸后暴露提睪肌,沿提睪肌對側(cè)血管大分支較少的位置剪開,完整剝下提睪肌,并將睪丸及副睪送還腹腔,將提睪肌固定于操作臺的玻片上。經(jīng)股靜脈插管注射5%異硫氰酸熒光素標(biāo)記的右旋糖酐(MW 15000,6ml/kg),5分鐘后用裝有100瓦汞燈的落射顯微鏡燈經(jīng)紫外濾光片(450—490nm)對提睪肌微血管行局部照射,同時在顯微攝像系統(tǒng)觀察血栓形成的情況和測量不同時間點(diǎn)血管的狹窄程度,然后取材行病理學(xué)切片檢查。所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析,所有數(shù)據(jù)均以(?)±s表示,各時間點(diǎn)間狹窄程度比較用單向方差分析(One-way ANOVA),各劑量組內(nèi)狹窄程度比較用重復(fù)測量方差分析,劑量與時間之間是否存在交互效應(yīng)用重復(fù)測量的方差分析。差異性檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為P＜0.05(雙側(cè))。 結(jié)果:第一部分:1、采用庫爾特計數(shù)儀測得MB平均粒徑為2.83um,濃度約為1.5×10~9個/ml。MBp分布基本均勻,采用庫爾特計數(shù)儀測得其平均粒徑2.73um,濃度7.1×10~8個/ml。2、MBp制備后,采用綠色熒光標(biāo)記的二抗與抗P-選擇素單抗結(jié)合,熒光顯微鏡下觀察顯示MBp呈明顯綠色熒光,表明生物素化抗P-選擇素單抗可通過抗生物素蛋白(抗生蛋白鏈菌素)與生物素化脂質(zhì)微泡有效連接。3、MBp的第一幀CEU圖像顯示IR組缺血再灌注下肢骨骼肌可見顯著的超聲顯影,而未缺血組骨骼肌無明顯的超聲顯影;MB的第一幀CEU圖像在IR組缺血再灌注骨骼肌可見輕度的超聲顯影,其顯影強(qiáng)度較MBp的IR組缺血再灌注骨骼肌明顯減弱,而MB的第一幀CEU圖像在未缺血組骨骼肌中無明顯的超聲顯影。4、MB的Ⅵ值在IR組及未缺血組有顯著性差異(P＜0.05),MBp在IR組的Ⅵ值較未缺血組顯著增強(qiáng)(P＜0.05);兩種造影劑在未缺血組的Ⅵ值無顯著性差異(P＞0.05),而MBp在IR組的Ⅵ值明顯高于MB(P＜0.05)。5、下肢骨骼肌病理檢查示未缺血下肢骨骼肌細(xì)胞形態(tài)正常,無充血、水腫;IR組骨骼肌細(xì)胞水腫,內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞浸潤。 第二部分:1、注射劑量及熒光照射時間與狹窄程度的關(guān)系:5組中除0.2ml組外,其它4組血管均在30分鐘內(nèi)完全閉塞,0.4ml～0.6ml組的血管完全閉塞時間較0.3ml組顯著減少(P＜0.01),但0.4ml～0.6ml組之間無顯著性差異(P＞0.05)。血管閉塞后30分鐘均無自溶。2、顯微鏡下血栓形成過程:靶血管血流在熒光照射前正常,血流速度很快,呈線流,注射FITC-dextran 0.4ml,熒光照射后最先出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、收縮,血管壁增厚,血流中的白細(xì)胞移向血管壁并附壁翻滾,最終粘附于血管壁,形成“白微栓”;紅細(xì)胞凝集成團(tuán)塊狀,血流速度逐漸變慢,隨著照射時間的延長,血栓范圍逐漸增大,可見到血栓栓子脫落,隨血流前行,最后靶血管完全閉塞,血流停止。但未照射部位的血管血流正常。3、病理學(xué)檢查示微血管內(nèi)有血栓形成,內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,血栓為紅血栓。 結(jié)論:第一部分:1、我們成功的采用“抗生物素蛋白/生物素復(fù)合體”將大鼠抗小鼠P-選擇素抗體與普通脂質(zhì)微泡相結(jié)合制備成P-選擇素單抗靶向微泡。2、P-選擇素靶向微泡造影劑結(jié)合對比超聲可有效評價骨骼肌I-R的早期炎癥反應(yīng),將可用于評價微血管炎癥或相關(guān)的血管內(nèi)皮反應(yīng)。 第二部分:靜脈注射FITC-dextran經(jīng)光化學(xué)法建立大鼠提睪肌微循環(huán)血栓模型是一種簡單、可靠的方法。在注射0.2ml時血管不會完全閉塞,其形成機(jī)制與臨床病理機(jī)制相同,在熒光活體顯微鏡下可觀察血栓形成的全過程,為血栓靶向微泡的微循環(huán)實(shí)驗(yàn)提供了一個新的方法。注射0.3ml以上時微血管可完全閉塞,可用于觀察藥物溶栓效果的實(shí)驗(yàn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R445.1;R363;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1360063