本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用免疫磁珠法分離提純雪旺細(xì)胞及其增殖的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 雪旺細(xì)胞 免疫磁珠 堿性成纖維細(xì)胞生長因子 硫酸乙酰肝素蛋白多糖

【摘要】： 雪旺細(xì)胞(Schwann cells,SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的主要膠質(zhì)細(xì)胞,在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中起決定性作用,它能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)軸突的發(fā)芽再生;為再生軸突的延伸和生長提供隧道。所以,目前認(rèn)為雪旺細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)及神經(jīng)組織工程中有良好的應(yīng)用前景。在體外培養(yǎng)中,成纖維細(xì)胞的增殖速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于雪旺細(xì)胞,使雪旺細(xì)胞的分離和提純因成纖維細(xì)胞的污染而變得困難。因此如何快速獲取大量、高純度、高活性雪旺細(xì)胞目前仍是制約雪旺細(xì)胞移植的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過免疫磁珠法分離及提純雪旺細(xì)胞,并配置一種能夠使雪旺細(xì)胞快速增殖的培養(yǎng)液配方。 實(shí)驗(yàn)一應(yīng)用免疫磁珠法分離及提純雪旺細(xì)胞 選用4～7d SD大鼠,無菌條件下取雙側(cè)坐骨神經(jīng),長約1cm,解剖鏡下顯微剝離去除神經(jīng)外膜,獲得神經(jīng)束。將神經(jīng)束剪碎至約1mm3大小顆粒。采用雙酶二次消化法消化,加入胎牛血清中止消化后,離心并加入DF12培養(yǎng)液培養(yǎng)。7d后應(yīng)用免疫磁珠法對細(xì)胞進(jìn)行純化培養(yǎng),培養(yǎng)2d后進(jìn)行傳代接種。培養(yǎng)過程中對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,計(jì)數(shù)及活力測定;MTT法繪制細(xì)胞生長曲線,采用免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色對細(xì)胞進(jìn)行鑒定并且計(jì)算所得細(xì)胞純度。結(jié)果:經(jīng)S-100及免疫熒光鑒定所得細(xì)胞為雪旺細(xì)胞;采用免疫磁珠法能對培養(yǎng)所得雪旺細(xì)胞進(jìn)行純化。純化后雪旺細(xì)胞活力為96%,純度98%,培養(yǎng)2d后就可以傳代。結(jié)論:免疫磁珠法可以用于雪旺細(xì)胞的純化培養(yǎng),所得雪旺細(xì)胞純度高,活力強(qiáng),能滿足組織工程人工神經(jīng)的需要。 實(shí)驗(yàn)二雪旺細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究 取生長良好的第二代雪旺細(xì)胞,經(jīng)消化制成單細(xì)胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板,接種密度為1×104/ml,每塊6×12孔,200ul/孔,共接種9個(gè)樣本。實(shí)驗(yàn)分成6組(每組12孔):A組為空白對照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)液);B組為含50ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor bFGF)培養(yǎng)液組;C組為含50ng/ml硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparin sulfate proteoglycan protein,HSPG)培養(yǎng)液組;D組為含100ng/ml HSPG細(xì)胞培養(yǎng)液組;E組為含50ng/mlbFGF +50ng/ml HSPG細(xì)胞培養(yǎng)液組;F組為含50ng/ml bFGF +100ng/mlHSPG細(xì)胞培養(yǎng)液組。37oC,5%CO2培養(yǎng),每日固定時(shí)間取板1塊(每間隔24h取板1塊),酶聯(lián)免疫檢測儀測吸光度值(A值/OD值),激發(fā)波長:490nm,計(jì)算當(dāng)日各組A值均數(shù),以時(shí)間為橫軸,光吸收值為縱軸繪制生長曲線。結(jié)果:B、C、D、E、F組均優(yōu)于對照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);B、C、D組沒有明顯差別,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);E、F組均優(yōu)于B、C、D組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);E、F組沒有明顯差別,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論:用含bFGF + HSPG細(xì)胞培養(yǎng)液能夠使雪旺細(xì)胞快速增殖;含50ng/mlbFGF +100ng/ml HSPG細(xì)胞培養(yǎng)液(F組)生長最旺盛,E、F組第9天到分裂頂峰期;A、B、C、D第7天到分裂頂峰期。
[Abstract]:Schwann cells (Schwann cells SCs) is the main glial cells of the peripheral nervous system, play a decisive role in the repair of peripheral nerve injury, it can sprouting secretion of various neurotrophic factors to promote neurite extension; axonal regeneration and growth of tunnel. So, the Schwann cell has a good application prospect in the surrounding repair of nerve injury and nerve tissue engineering. In vitro, fibroblast proliferation is much faster than that of Schwann cells, separation and purification of Schwann cells and fibroblasts become difficult because of pollution. So how to obtain a large amount, high purity, high activity of Schwann cells is the key restriction of Schwann cell transplantation. The purpose of this experiment is through immunomagnetic separation and purification of Schwann cells, and the allocation of a party can make the medium with the rapid proliferation of Schwann cells.
Isolation and purification of Schwann cells by immunomagnetic beads
With 4 ~ 7d SD rats were dissected under sterile conditions and bilateral sciatic nerve, the length of about 1cm, under the anatomical microscope microscopic stripping removal of epineurium, obtain the nerve bundle. The nerve bundle was cut to about the size of 1mm3 particles. The digestion of two double enzyme digestion method, adding fetal bovine serum suspension after digestion with DF12 culture application of immunomagnetic liquid culture after.7d cells were purified and cultured on centrifugation and cultured 2D were inoculated culture. To observe the morphology of cells during the process of counting and determination of activity; cell growth curve was drawn by MTT staining, the cells were identified and calculated the purity of cells by immunocytochemistry. Results: after fluorescence S-100 and immunofluorescence to identify the cells into Schwann cells; using immunomagnetic beads can be used to purify the Schwann cells. The purified Schwann cell activity was 96%, the purity of 98%, after 2D culture can be passaged. Conclusion: The immunomagnetic bead method can be used in the purification and culture of Schwann cells. The purity and vitality of Schwann cells can meet the needs of the tissue engineering artificial nerve.
Experimental study on the proliferation of Schwann cells in experiment two
The second generation of good growth of Schwann cells, digested into single cell suspension, were seeded in 96 well plates, inoculum density is 1 * 104/ml, each 6 x 12 holes, 200ul/ hole, together with 9 samples. The experiment was divided into 6 groups (each 12 hole): group A (Foundation medium); group B growth factor 50ng/ml containing basic fibroblast (basic fibroblast growth factor bFGF) medium group; C group containing 50ng/ml heparan sulfate proteoglycan (Heparin Sulfate Proteoglycan Protein, HSPG) medium group; group D nutrient solution containing 100ng/ml group HSPG E group cultured cell culture; liquid group containing 50ng/mlbFGF +50ng/ml HSPG cells; group F medium group.37oC, containing 50ng/ml bFGF +100ng/mlHSPG 5%CO2 cells were cultured, fixed time daily from 1 boards (every 24h 1 boards), the absorbance measured the enzyme immunoassay (A / OD), excitation wavelength: 490nm, calculate the date the A values of each group The average number of time as the horizontal axis, the light absorption value of growth curve for the vertical axis. Results: B, C, D, E, F group was better than the control group, there was statistical significance (P0.05); B, C, D group have no obvious difference, no statistical significance (P0.05); E, F were significantly higher than those of B, C, D group, with statistical significance (P0.05); E F group, no significant difference was not statistically significant (P0.05).
Conclusion: using bFGF + HSPG cell culture medium can make Schwann cells proliferate rapidly. The growth of 50ng/mlbFGF +100ng/ml HSPG cell culture medium (F group) is the most vigorous, E, F group ninth days to the peak stage of division, A, B, C, and seventh days to the peak of division.

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R651;R329

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫秀蘭;劉偉偉;張銀志;樊惠良;陳文君;;趨磁細(xì)菌研究進(jìn)展[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2011年06期

2 許勇峰;劉嵐;張成;;大鼠脂肪干細(xì)胞源性神經(jīng)球分化為雪旺細(xì)胞樣細(xì)胞[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年07期

3 陶曉宇;滕曉華;劉波;段答;盧明;;改良新生大鼠雪旺細(xì)胞的體外培養(yǎng)和純化[J];湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào);2011年03期

4 宋衛(wèi)東;邱太彬;王光耀;陳皓;侯念宗;沈慧勇;劉尚禮;;高糖培養(yǎng)對雪旺細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子分泌的影響[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2011年13期

5 施新革;宗海斌;董玉珍;侯文根;梁秋冬;;陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子-3在大鼠雪旺細(xì)胞中的表達(dá)[J];軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào);2011年09期

6 楊潔;吳琪;張鴻雁;盧靜;霍興華;李振華;;毛囊神經(jīng)嵴干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及其向雪旺細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究[J];齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年08期

7 焦海山;姚健;劉曉梅;林乃祥;林巍巍;陳雪;李奕;王曉冬;;自體神經(jīng)橋接陳舊性周圍神經(jīng)缺損后雪旺細(xì)胞的組織學(xué)觀察[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2011年04期

8 劉炎;張莉;宮旭;陳繼鳳;王玉;趙斌;任志午;詹勝峰;許文靜;彭江;盧世璧;;雙向差速法制備高純度雪旺細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國矯形外科雜志;2011年16期

9 王宏偉;陸江陽;田光;劉茜;趙敏;楊毅;康佳蕊;;小鼠肺間質(zhì)樹突狀細(xì)胞的分離、純化與鑒定[J];中國免疫學(xué)雜志;2011年09期

10 施新革;宗海斌;董玉珍;侯文根;梁秋冬;;神經(jīng)營養(yǎng)因子3基因修飾的雪旺細(xì)胞對神經(jīng)損傷的修復(fù)作用[J];軍事醫(yī)學(xué);2011年07期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 陳罡;張志君;程瓊;韋中亞;顧曉松;;雪旺細(xì)胞中溶酶體的胞吐現(xiàn)象及機(jī)制研究[A];中國解剖學(xué)會(huì)2011年年會(huì)論文文摘匯編[C];2011年

2 許家軍;陳爾瑜;路長林;何成;;重組CNTF對受損坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞的作用及機(jī)制[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會(huì)2002年年會(huì)文摘匯編[C];2002年

3 白鶴;楊志;趙勁民;蘇偉;;乳鼠雪旺細(xì)胞純化培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[A];2005'中國修復(fù)重建外科論壇論文匯編[C];2005年

4 薄占東;趙勁民;楊志;蘇偉;洪光祥;;ATP對體外培養(yǎng)的大鼠雪旺細(xì)胞的作用[A];2005'中國修復(fù)重建外科論壇論文匯編[C];2005年

5 程飚;張誠;李伯休;出曉軍;;電穿孔轉(zhuǎn)染hTERT基因使SD大鼠雪旺細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)及壽命延長的研究[A];第七屆全國創(chuàng)傷學(xué)術(shù)會(huì)議暨2009海峽兩岸創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)論壇論文匯編[C];2009年

6 秦建強(qiáng);黃濤;熊紹虎;余磊;霍霄鯤;廖華;劉曉靜;劉大庸;;雪旺細(xì)胞表達(dá)巨噬細(xì)胞游走抑制因子mRNA的實(shí)驗(yàn)研究[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會(huì)2002年年會(huì)文摘匯編[C];2002年

7 袁碧波;蔡文琴;張金海;吳喜貴;范曉棠;;嗅球成鞘細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及與雪旺細(xì)胞的比較研究[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會(huì)2002年年會(huì)文摘匯編[C];2002年

8 馮世慶;李暉;周先虎;侯巍;馬信龍;王沛;郭世紱;;自體激活雪旺細(xì)胞移植治療慢性脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究[A];第八屆全國脊柱脊髓損傷學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2007年

9 王瑾;王艷華;張培訓(xùn);寇玉輝;張宏波;姜保國;;大鼠坐骨神經(jīng)損傷后不同修復(fù)方法下雪旺細(xì)胞表型的改變規(guī)律[A];第七屆全國創(chuàng)傷學(xué)術(shù)會(huì)議暨2009海峽兩岸創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)論壇論文匯編[C];2009年

10 高偉;邵水金;胡琳娜;;電針對坐骨神經(jīng)損傷模型大鼠雪旺細(xì)胞增殖機(jī)制的研究[A];中國解剖學(xué)會(huì)2011年年會(huì)論文文摘匯編[C];2011年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 吳一福;我國脊髓神經(jīng)損傷治療邁上新臺階[N];中國醫(yī)藥報(bào);2007年

2 陳茂j 王彬;腫瘤血行轉(zhuǎn)移檢測有新法[N];健康報(bào);2006年

3 陳茂j 王彬;外周血中查惡性腫瘤細(xì)胞有新方法[N];中國醫(yī)藥報(bào);2006年

4 吳一福;四軍醫(yī)大制備成功仿生神經(jīng)新型支架材料[N];中國醫(yī)藥報(bào);2006年

5 馮衛(wèi)東;來自頭發(fā)的新材料[N];科技日報(bào);2008年

6 樓谷音;腫瘤學(xué)的進(jìn)步：外周血惡性腫瘤細(xì)胞檢測[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2003年

7 記者 張璐;腸出血性大腸桿菌一測即知[N];天津日報(bào);2011年

8 本報(bào)記者 孫春艷;厚積薄發(fā)[N];吉林日報(bào);2007年

9 蔣家勝;人造血干細(xì)胞體內(nèi)歸巢研究獲突破[N];科技日報(bào);2006年

10 鄭靈巧;O157防治研究獲系列重大成果[N];健康報(bào);2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李巖峰;激活態(tài)雪旺細(xì)胞臨床應(yīng)用安全性的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

2 丁維進(jìn);誘導(dǎo)人眼輪匝肌來源肌源干細(xì)胞分化為類雪旺細(xì)胞的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

3 黃小輝;NT-3轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞在外周神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 孫連慶;波動(dòng)性高糖對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞凋亡通路的影響及干預(yù)研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2012年

5 袁碧波;大鼠嗅成鞘細(xì)胞和雪旺細(xì)胞基因表達(dá)差異的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

6 吳志偉;人胚雪旺細(xì)胞組織工程神經(jīng)的構(gòu)建[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

7 何繼銀;激活態(tài)雪旺細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2007年

8 唐乙;體外誘導(dǎo)小鼠肌源干細(xì)胞向類雪旺細(xì)胞分化的條件和機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

9 章少華;轉(zhuǎn)錄因子stat3調(diào)控激活態(tài)雪旺細(xì)胞基因表達(dá)的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

10 蔣良福;激活態(tài)雪旺細(xì)胞與幾丁糖—膠原膜修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 黃明;應(yīng)用免疫磁珠法分離提純雪旺細(xì)胞及其增殖的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

2 秦煜;神經(jīng)特異性再生中感覺性、運(yùn)動(dòng)性雪旺細(xì)胞NGF-mRNA、NGF及其p75受體表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2000年

3 閻華;大鼠神經(jīng)干細(xì)胞和雪旺細(xì)胞體外共培養(yǎng)生長特性和聯(lián)合移植于脊髓損傷[D];天津醫(yī)科大學(xué);2003年

4 李輝;C3轉(zhuǎn)移酶聯(lián)合雪旺細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

5 葉震海;周圍神經(jīng)組織工程研究雪旺細(xì)胞和PLA材料復(fù)合種植的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2000年

6 魏海峰;雪旺細(xì)胞源性神經(jīng)細(xì)胞粘附分子L1對損傷脊髓修復(fù)作用的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

7 張勇杰;周圍神經(jīng)缺損的組織工程方法修復(fù)[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

8 馬立;兔雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)及復(fù)合PLGA導(dǎo)管修復(fù)面神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

9 黃罡;雪旺細(xì)胞及靜脈套管對周圍神經(jīng)缺損再生影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2005年

10 遲建光;Ad-BDNF轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)乳鼠雪旺細(xì)胞的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2008年

，

本文編號：1359786