本文關(guān)鍵詞：GDNF及其受體在人黃素化顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及促性腺激素對其表達(dá)的調(diào)控　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 1993年,人們首次從大鼠B49膠質(zhì)細(xì)胞系中分離、純化并成功克隆了一種新的神經(jīng)營養(yǎng)因子,即膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF),最初因其可以促進(jìn)多種神經(jīng)元的存活、生長及分化,調(diào)控著胚胎時期腎臟發(fā)育及輸尿管分支形成,促進(jìn)精原細(xì)胞分化及更新而展開了一系列的研究。GDNF主要通過結(jié)合特異性受體而起作用,GDNF家族特異性受體家族(GDNF family receptorα, GFRα)通過C端的糖磷酯酰肌醇鍵錨定在細(xì)胞表面,但缺乏胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,因此GFRα只是GDNF功能性受體的一部分。GDNF與特異性受體GFRα-1結(jié)合形成二聚體復(fù)合物后再引導(dǎo)著另一部分功能性受體即Ret (rearranged during transfection)蛋白與之結(jié)合,形成三聚體復(fù)合物。Ret是在基因轉(zhuǎn)染過程中可以重排的RET基因的蛋白產(chǎn)物,也是受體酪氨酸激酶家族的新成員,具有典型的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu),GDNF-GFRα-Ret復(fù)合物形成之后,Ret發(fā)生磷酸化,從而激活下游胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的的發(fā)生。令人感興趣的是,利用原位雜交技術(shù)檢測小鼠體內(nèi)15個器官發(fā)現(xiàn),卵巢內(nèi)GDNFmRNA的表達(dá)水平最為顯著,且研究證實,GDNF可以促進(jìn)豬始基卵泡向初級卵泡發(fā)育,增加小鼠卵母細(xì)胞第一極體的排出率及促進(jìn)胚胎向囊胚期發(fā)育,因此研究GDNF在卵巢內(nèi)的作用對進(jìn)一步闡明卵泡生發(fā)、成熟及胚胎發(fā)育過程具有重要意義。但是目前為止,關(guān)于GDNF及其受體在人卵巢內(nèi)表達(dá)的研究仍鮮有報道。并且,在小鼠體內(nèi),GDNF及GFRα-1的表達(dá)量隨著卵泡的發(fā)育在LH峰出現(xiàn)后達(dá)到最高值,敲除了卵泡刺激素受體基因后,小鼠體內(nèi)GDNF分泌量呈雙峰式,提示促性腺激素對GDNF及其受體存在著一定的調(diào)控作用,那么,在人卵巢內(nèi),促性腺激素是否也存在著對GDNF及其受體表達(dá)的調(diào)控作用呢?又是如何參與調(diào)控的呢?本研究擬以GDNF在生殖方面的研究及其他組織研究為基礎(chǔ),檢測GDNF及其受體在人排卵前黃素化顆粒細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況,觀察促性腺激素對GDNF及其受體mRNA表達(dá)水平的影響,初步探討GDNF在卵泡發(fā)育成熟過程中的作用機制。 第一部分人黃素化顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定 [研究目的] 通過建立穩(wěn)定的人黃素化顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)系統(tǒng),觀察細(xì)胞形態(tài)及生長周期,體外鑒定顆粒細(xì)胞純度,為后續(xù)研究提供實驗基礎(chǔ)。 [研究方法] 人黃素化顆粒細(xì)胞取自2009年5月至2009年12月因輸卵管因素或男方因素不孕而在南方醫(yī)院生殖中心行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)治療的婦女8例,均使用黃體期長方案降調(diào)節(jié),且年齡位于25-30歲,月經(jīng)第三天基礎(chǔ)卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)≤7.5mIU/ml,人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)日血清雌二醇(estradiol,E2) 4000pg/ml,19kg/m2體重指數(shù)(body mass index, BMI)23kg/m2,無排卵功能障礙,月經(jīng)周期正常。 用Percoll梯度離心法提取卵泡液內(nèi)的顆粒細(xì)胞,按2×105／L接種于35mm培養(yǎng)皿中,每皿加入2ml RPMI-1640培養(yǎng)基,20ul青霉素-鏈霉素溶液,500ul胎牛血清,置于5%CO2、37℃孵箱,24小時后棄去未貼壁細(xì)胞,更換完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)基成分與前相同,每隔24h觀察細(xì)胞形態(tài)及拍照。 原代顆粒細(xì)胞鑒定時,將原代顆粒細(xì)胞提純后,加入約2ml已配置好的完全培養(yǎng)基后,懸起清洗后的細(xì)胞沉淀,在10cm皿中放置經(jīng)多聚賴氨酸處理的防脫載玻片,小心將細(xì)胞懸液均勻滴至載玻片上,勿使細(xì)胞懸液滴至載玻片外區(qū)域,將培養(yǎng)皿放置孵箱過夜后以1：50稀釋兔抗人卵泡刺激素受體(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR)多克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。 [結(jié)果] 1、8個病人,8個IVF周期,平均年齡(26.4±1.2)歲,平均BMI為(21.3±1.3)kg／m2,月經(jīng)第三天平均基礎(chǔ)FSH水平為(6.8±0.5) mIU/ml, HCG日平均血清E2水平為(1493.2±755.1) pg/ml。 2、人黃素化顆粒細(xì)胞在體外生長緩慢,在倒置顯微鏡下觀察,接種時呈圓形,表面可見深色顆粒狀物質(zhì),24小時內(nèi),顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)貼壁生長,明顯可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顏色深,粗大的,較多的顆粒狀物質(zhì),培養(yǎng)基內(nèi)可見少量紅細(xì)胞懸浮其中,換液后,紅細(xì)胞基本去除干凈；48小時后,單層顆粒細(xì)胞均勻滿布培養(yǎng)皿中,外觀呈梭狀或星狀,伸出細(xì)長偽足,細(xì)胞與細(xì)胞間通過偽足連接緊密,胞質(zhì)內(nèi)顆粒狀物質(zhì)豐富,細(xì)胞核圓,大,胞漿飽滿,透光好；72小時后,細(xì)胞各組生長形態(tài)無明顯改變,未見明顯細(xì)胞增殖；培養(yǎng)96小時,部分顆粒細(xì)胞內(nèi)顆粒狀物質(zhì)消失,胞漿減少,出現(xiàn)類似成纖維細(xì)胞形態(tài)；培養(yǎng)120小時,部分顆粒細(xì)胞內(nèi)顆粒狀物質(zhì)增多,增粗,體型肥大,偽足短,無明顯張力；培養(yǎng)216小時,部分培養(yǎng)皿中顆粒細(xì)胞脫落死亡,集結(jié)呈團(tuán)狀,懸浮于培養(yǎng)液中,培養(yǎng)至第15天,顆粒細(xì)胞完全脫顆粒、呈纖維樣變,失去原來的細(xì)胞形態(tài)。 3、原代培養(yǎng)人黃素化顆粒細(xì)胞鑒定：FSHR僅存在于卵巢顆粒細(xì)胞中,FSHR免疫細(xì)胞化學(xué)染色是鑒定顆粒細(xì)胞的特異性染色,FSHR陽性染色定位于細(xì)胞胞漿,呈深棕色,細(xì)胞核呈藍(lán)色,鏡下可見FSHR的陽性率為70%-80%。 [小結(jié)] 1、利用45%percoll分離法能有效去除卵泡液中大部分紅細(xì)胞。 2、利用RPMI-1640完全培養(yǎng)基時,培養(yǎng)72小時,細(xì)胞未出現(xiàn)明顯增殖,培養(yǎng)至96小時,細(xì)胞出現(xiàn)退行性改變,提示96小時之前,細(xì)胞呈典型顆粒細(xì)胞形態(tài),無明顯脫落死亡現(xiàn)象,生長穩(wěn)定,適宜行體外實驗。 3、經(jīng)鑒定,從卵泡液內(nèi)分離純化接種的是人顆粒細(xì)胞,純度達(dá)70%以上,符合實驗要求。 第二部分GDNF及其受體在人黃素化顆粒細(xì)胞中的表達(dá) [研究目的] 通過對體外培養(yǎng)原代黃素化顆粒細(xì)胞進(jìn)行GDNF、GFRα-1、Ret免疫細(xì)胞化學(xué)染色,證實GDNF、GFRα-1、Ret在人黃素化顆粒細(xì)胞中的表達(dá)情況,提不GDNF及其受體對卵泡發(fā)育起了一定的調(diào)控作用,為后續(xù)研究提供實驗依據(jù)。 [研究方法] 人黃素化顆粒細(xì)胞標(biāo)本取自2009年5月至2009年12月因輸卵管因素或男方因素不孕而在南方醫(yī)院生殖中心行IVF-ET治療的婦女15例,均使用黃體期長方案降調(diào)節(jié),且年齡位于25～30歲,月經(jīng)第三天基礎(chǔ)FSH≤7.5mIU/ml, HCG日E24000pg/ml,19 kg/m2 BMI 23 kg/m2,月經(jīng)周期正常,無排卵功能障礙。 用45%Percoll分離液提取分離顆粒細(xì)胞,將細(xì)胞懸液直接滴至于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上,放置過夜后,將爬片用4%多聚甲醛固定20-30min,分別按1：200稀釋兔抗人GDNF多克隆抗體,1：200稀釋兔抗人GFRα-1多克隆抗體,鼠抗人Ret單克隆抗體原液進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。 [結(jié)果] 1、15個病人,15個IVF-ET周期,平均年齡(26.7±2.0)歲,平均BMI為(21.5±1.2)kg／m2,月經(jīng)第三天平均基礎(chǔ)FSH水平為(6.7±0.6)mIU/ml, HCG日平均血清E2水平為(2009.6±850.7) pg/ml; 2、GDNF陽性染色定位于細(xì)胞胞漿及細(xì)胞核內(nèi),鏡下可見GDNF在胞漿內(nèi)的染色陽性率幾近100%,胞核內(nèi)陽性率為97%； 3、GFRα-1陽性染色定位于細(xì)胞胞漿及細(xì)胞核內(nèi),鏡下可見GFRα-1在胞漿內(nèi)的染色陽性率幾近100%,胞核內(nèi)陽性率為55%； 4、Ret陽性染色定位于細(xì)胞胞漿及細(xì)胞核內(nèi),鏡下可見Ret在胞漿內(nèi)的染色陽性率為47%,胞核內(nèi)陽性率為17%。 [小結(jié)] GDNF、GFRα-1、Ret均表達(dá)于人黃素化顆粒細(xì)胞核及細(xì)胞漿內(nèi),提示GDNF可能通過自分泌與旁分泌的機制參與卵泡生長發(fā)育的過程。 第三部分促性腺激素對GDNF、GFRα-1及Ret在人黃素化顆粒細(xì)胞中表達(dá)的影響 [研究目的] 通過在體外培養(yǎng)基中添加不同濃度的人絕經(jīng)期促性腺激素(human menopausal gonadotropin, HMG)及FSH,檢測黃素化顆粒細(xì)胞內(nèi)GDNFmRNA、GFRα-1mRNA、RETmRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化,以期尋找促性腺激素調(diào)控GDNF及其受體表達(dá)的可能機制,深入認(rèn)識GDNF在卵泡發(fā)育成熟中的作用。 [研究方法] 將5例病人黃素化顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外原代培養(yǎng),培養(yǎng)方法同前,實驗采用隨機區(qū)組設(shè)計：分為四個處理組,即空白對照組(簡稱對照組)、HMG 5IU/L組(簡稱5IU組)、HMG 10IU/L組(簡稱10IU組),FSH10IU/L組(簡稱FSH組),以每個病人為一個配伍組,每個病人卵泡液內(nèi)分離純化的細(xì)胞,均勻按2×105／L密度接種,共接種于四個培養(yǎng)皿中,隨機接受四種不同處理,體外培養(yǎng)至72h,收取細(xì)胞的總RNA,采用SYBR Green染料法進(jìn)行Real time PCR檢測,運用2-△△Ct法對各實驗組中GDNFmRNA、GFRα-1mRNA、RETmRNA相對表達(dá)量進(jìn)行分析。 用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示。當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時,隨機區(qū)組設(shè)計多個樣本比較采用隨機單位組設(shè)計的方差分析,其中多重比較采用S-N-K法；設(shè)雙側(cè)檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 [結(jié)果] 1、5例病人,5個IVF-ET周期,平均年齡(27.2±1.9)歲,平均BMI為(21.7±0.7)kg／m2,月經(jīng)第三天基礎(chǔ)平均FSH水平為(6.8±0.5) mIU/ml, HCG日平均血清E2水平為(1892.2±396.4) pg/ml. 2、對照組、5IU組,10IU組、FSH組進(jìn)行隨機單位組設(shè)計資料方差分析,四組相比,GDNFmRNA的表達(dá)量具有顯著性差異(F=22.308,P0.01),其中10IU組GDNFmRNA表達(dá)量最高,比對照組高4.37倍,其次為5IU組表達(dá)量比對照組高2.76倍,對照組表達(dá)量最低。病人個體間有顯著性差異(F=6.283,P=0.006),說明配伍組設(shè)計有效,經(jīng)過S-N-K多重比較,5IU組及10IU組的表達(dá)量均顯著高于空白組及FSH組,且10IU組GDNFmRNA表達(dá)量顯著高于5IU組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3、各處理組計量資料均滿足正態(tài)分布,對照組、5IU組,10IU組、FSH組進(jìn)行隨機單位組設(shè)計資料方差分析,四組相比,GFRα-1mRNA的表達(dá)量具有顯著性差異(F=18.985,P0.01),其中10IU組GFRα-1mRNA表達(dá)量最高,比對照組高4.86倍,其次為5IU組表達(dá)量比對照組高3.23倍,FSH組表達(dá)量最低,病人個體間有顯著性差異(F=4.568,P=0.018),說明配伍組設(shè)計有效,經(jīng)過S-N-K組間多重比較,5IU組及10IU組的表達(dá)量均顯著高于空白組及FSH組,且1 0IU組GFRα-1mRNA表達(dá)量顯著高于5IU組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4、各處理組計量資料均滿足正態(tài)分布,對照組、5IU組,10IU組、FSH組進(jìn)行隨機單位組設(shè)計資料方差分析,四組相比,RETmRNA的表達(dá)量均無統(tǒng)計學(xué)差異(F=2.026,P=0.164)。 [小結(jié)] 1、當(dāng)單獨在培養(yǎng)基中添加FSH的濃度為10IU／L時,未能顯著上調(diào)GDNFmRNA、GFRα-1mRNA、RETmRNA的表達(dá)水平,提示FSH在此濃度下不能對上述mRNA的表達(dá)起上調(diào)作用,但不能完全排除FSH在維持卵泡內(nèi)GDNF表達(dá)量動態(tài)平衡方面的作用。 2、當(dāng)使用HMG的濃度為5IU／L時,與對照組相比,可顯著上調(diào)顆粒細(xì)胞GDNFmRNA及GFRα-1mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,當(dāng)劑量增加到10IU／L時,GDNFmRNA及GFRα-1m RNA的轉(zhuǎn)錄水平隨著HMG用量的增長而增長,呈劑量依賴性,提示排卵前LH峰促進(jìn)卵母細(xì)胞的最終成熟及排卵可能是通過上調(diào)GDNF的分泌水平來實現(xiàn)的,GDNF可能是介導(dǎo)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的信號機制之一。 3、HMG及FSH均不能上調(diào)黃素化顆粒細(xì)胞內(nèi)RETmRNA的表達(dá)水平,提示除了GDNF-GFRα-Ret信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制外,可能存在著其他的GDNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與卵泡生長發(fā)育的過程。 [全文總結(jié)] 1、45%percoll分離法能有效分離卵泡液顆粒細(xì)胞,接種后細(xì)胞純度70%。 2、利用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人黃素化顆粒細(xì)胞,培養(yǎng)至96小時之前,顆粒細(xì)胞形態(tài)典型,無明顯脫顆粒及死亡現(xiàn)象,適宜進(jìn)行體外實驗。 3、首次發(fā)現(xiàn)GDNF、GFRα-1、Ret表達(dá)于人黃素化顆粒細(xì)胞核及細(xì)胞漿內(nèi),提示,GDNF可能通過自分泌與旁分泌途徑參與卵母細(xì)胞的生長發(fā)育成熟過程。 4、首次證實HMG能顯著上調(diào)人黃素化顆粒細(xì)胞內(nèi)GDNFmRNA、GFRα-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,并呈劑量依賴性,而單獨使用FSH的濃度為10IU／L時未見此上調(diào)作用,提示LH促進(jìn)顆粒細(xì)胞分泌GDNF并作用于顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞可能是LH調(diào)控卵泡發(fā)育成熟的機制之一,但不能完全排除FSH在維持卵泡內(nèi)GDNF表達(dá)量動態(tài)平衡方面的作用。 5、HMG及FSH均不能上調(diào)黃素化顆粒細(xì)胞內(nèi)RETmRNA的表達(dá)水平,提示除了GDNF-GFRα-Ret信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制外,可能存在著其他的GDNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與卵泡生長發(fā)育的過程。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R346

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：1356817