本文關(guān)鍵詞：線粒體融合、分裂在錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制的初步研究　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 【背景】 錳(Mn)是人體必需微量元素之一,參與許多生理過程,但如果攝取過多則會產(chǎn)生毒性作用。錳的慢性毒性主要表現(xiàn)為錐體外系神經(jīng)功能障礙,癥狀類似帕金森病的臨床表現(xiàn)。 線粒體在細(xì)胞生物活動中扮演著重要的角色,線粒體缺陷與多種疾病有關(guān)。錳對線粒體具有特殊的親和力,線粒體內(nèi)蓄積的錳可通過多種途徑引起線粒體損傷,導(dǎo)致線粒體功能障礙。已有研究證實線粒體功能障礙與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生關(guān)系密切。 線粒體是高度動態(tài)的細(xì)胞器,處于頻繁的融合與分裂過程,但是其生理意義尚不清楚。線粒體融合分裂的平衡對線粒體形態(tài)和功能的保持有著非常重要的作用,線粒體融合分裂異常總是伴隨線粒體功能障礙。線粒體分裂增多導(dǎo)致線粒體片段化,同時線粒體出現(xiàn)損傷,而線粒體融合增多可以改善線粒體功能,對細(xì)胞可能起到一定的保護(hù)作用。錳可通過多種途徑引起線粒體功能障礙,所以推測線粒體融合分裂可能參與了錳的神經(jīng)損傷過程。 線粒體融合分裂是由特定的分子執(zhí)行的。Mfn1和Mfn2是線粒體融合的主要執(zhí)行分子,OPA1也參與了這個過程。Mfn1和Mfn2全部缺失時,線粒體融合現(xiàn)象消失,線粒體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失,線粒體功能出現(xiàn)障礙。OPA1介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜的融合,OPA1表達(dá)抑制,可致細(xì)胞凋亡。Drp1和Fis1是線粒體分裂的重要執(zhí)行分子。Drp1是線粒體分裂的必需分子,Fis1介導(dǎo)線粒體分裂是依賴Drp1實現(xiàn)的。 【目的】 研究錳對細(xì)胞的損傷作用,從線粒體融合、分裂角度探討錳對神經(jīng)元的影響及其在錳誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用,從而為進(jìn)一步闡明錳神經(jīng)毒性的機(jī)制以及為錳中毒預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)�！痉椒ā�1)利用高分化型PC12細(xì)胞作為多巴胺能神經(jīng)元的細(xì)胞模型。2)應(yīng)用倒置顯微鏡、MTT方法、細(xì)胞計數(shù)方法、透射電鏡分析錳對細(xì)胞形態(tài)、生存活力以及生長增殖能力的影響。3)線粒體功能檢測試劑盒檢測錳對線粒體功能的影響。4)用Mito Tracker線粒體熒光探針標(biāo)記線粒體,熒光顯微鏡觀察線粒體形態(tài)變化,透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。5)用Western blot技術(shù)檢測錳對細(xì)胞線粒體融合、分裂蛋白表達(dá)的影響。6)利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法將預(yù)先合成的Drp1 siRNA轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞。 【結(jié)果】 1)錳對PC12細(xì)胞的損傷作用 MTT、細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示,錳作用使細(xì)胞生存活力下降,這種作用存在濃度-時間依賴效應(yīng)。倒置顯微鏡檢測結(jié)果表明錳作用細(xì)胞皺縮,細(xì)胞軸突變短及細(xì)胞漂浮現(xiàn)象。電鏡檢測可發(fā)現(xiàn)錳作用后細(xì)胞活性差。 2)線粒體融合分裂在錳誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中的作用 錳誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷,線粒體功能受到影響。線粒體功能檢測顯示線粒體膜電位減低、線粒體呼吸鏈酶Ⅱ、Ⅴ活性下降,ATP生成降低。同時,線粒體形態(tài)發(fā)生改變。細(xì)胞熒光顯微鏡顯示,對照組細(xì)胞線粒體長度均勻,長管狀或短小的線粒體較少。錳作用后,長管狀線粒體量明顯減少,大部分線粒體呈點狀(片段化),并且細(xì)胞變圓,皺縮,細(xì)胞胞體變大,突觸變短甚至消失。線粒體融合分裂蛋白檢測顯示線粒體融合蛋白Mfn2減低、分裂蛋白Drp1顯著增高。說明線粒體分裂相對增多,融合減少。 3)Drp1蛋白在錳誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中的重要作用 錳作用于PC12,細(xì)胞生長增殖抑制;線粒體分裂增多;線粒體分裂蛋白Drp1表達(dá)顯著增高。轉(zhuǎn)染Drp1 siRNA細(xì)胞,加錳作用后,Drp1 siRNA細(xì)胞與空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較,細(xì)胞活力增加,錳對細(xì)胞的增殖抑制作用減低;Drp1 siRNA細(xì)胞線粒體形態(tài)有所恢復(fù),長管狀線粒體增多,呈點狀線粒體明顯減少,線粒體融合增多。說明Drp1蛋白在錳誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中重要作用。 【結(jié)論】 1)錳誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷,細(xì)胞生長增殖抑制。這種作用可能是通過線粒體途徑調(diào)節(jié)的,線粒體功能損傷伴隨細(xì)胞損傷過程,表現(xiàn)為線粒體膜電位減低、線粒體呼吸鏈酶Ⅱ、Ⅴ活性下降,ATP生成降低。 2)線粒體融合、分裂過程參與了錳誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷過程,并且與線粒體功能障礙密切相關(guān)。錳作用使線粒體分裂增多,細(xì)胞損傷,活力下降,細(xì)胞增殖抑制。 3)初步證實了Drp1蛋白在錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷過程中可能起到重要作用。 綜上所述,本實驗初步闡明了錳對多巴胺能神經(jīng)元線粒體形態(tài)和功能的影響,線粒體融合分裂在錳誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷過程中的重要作用,為進(jìn)一步闡明錳神經(jīng)毒性的分子機(jī)制以及探尋有效的防護(hù)措施提供實驗依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1352171