本文關(guān)鍵詞：創(chuàng)傷弧菌消殺抗性及其菌體抗原、溶細(xì)胞毒素蛋白抗原主動(dòng)免疫的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 研究背景和目的 創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)是弧菌屬第5群細(xì)菌,根據(jù)其生化特性、流行病學(xué)模式以及宿主范圍將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個(gè)亞型,其中Ⅰ型Vv是導(dǎo)致人群創(chuàng)傷感染及原發(fā)性敗血癥的病原體。原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌感染發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)。目前世界上大部分沿海國家都有創(chuàng)傷弧菌感染的病例報(bào)告。我國國內(nèi)1990年報(bào)道首例,隨后沿海各地區(qū)每年都有散發(fā)病例報(bào)道,其病死率一直居高不下。對(duì)本病的認(rèn)識(shí)不足,發(fā)病早期未能正確診斷,或誤診為藥物超敏反應(yīng)而使用大劑量激素,是造成高病死率的主要原因。創(chuàng)傷弧菌的感染途徑有二:一是經(jīng)口感染,二是通過皮膚傷口侵入。創(chuàng)傷弧菌感染一旦出現(xiàn)敗血癥,其死亡率高達(dá)50%以上。那么,我們能否采取措施避免接觸到創(chuàng)傷弧菌呢?在不可避免接觸到創(chuàng)傷弧菌的情況下,我們能否通過機(jī)體主動(dòng)免疫的方法避免其感染乃至致病呢?為此,我們?cè)O(shè)計(jì)了本課題,試圖通過體外及主動(dòng)免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來回答上述問題。 方法 1.創(chuàng)傷弧菌的生化特性及抗性研究: 1.1取新鮮培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌接種于弧菌屬生化鑒定管及生化條培養(yǎng)24h后,目測(cè)或上機(jī)讀取鑒定結(jié)果。 1.2紫外線抗性:創(chuàng)傷弧菌ATCC27562、大腸桿菌ATCC25922懸液及平板在強(qiáng)度值達(dá)90μW/cm~2的紫外線照射不同時(shí)間后,培養(yǎng)并定量測(cè)試照射前后的活菌濃度,統(tǒng)計(jì)殺菌率,繪制照射前后滅活曲線(t-Δlg)。 1.3 3種消毒劑抗性:戊二醛、過氧乙酸及乙醇以無菌去離子水1:2等比系列稀釋至1:256后作用于創(chuàng)傷弧菌,培養(yǎng)24h觀察細(xì)菌生長情況,確定其對(duì)創(chuàng)傷弧菌的最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC);20g/L戊二醛、5g/L過氧乙酸及75%乙醇作用于創(chuàng)傷弧菌10s、20s、30s、60s、90s及120s,培養(yǎng)24h后觀察細(xì)菌生長情況,確定其對(duì)創(chuàng)傷弧菌的最快殺菌時(shí)效。 2.創(chuàng)傷弧菌主動(dòng)免疫預(yù)防的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 2.1創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素的提取、純化及鑒定 重組大腸桿菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21(DE3)恢復(fù)培養(yǎng),行藍(lán)白斑篩選,挑取白色菌斑進(jìn)行PCR擴(kuò)增并瓊脂糖電泳驗(yàn)證目的基因存在。挑選陽性克隆并以最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),離心收集細(xì)菌,超聲破菌,離心后上清液經(jīng)過His-Bind親和層析方法純化重組創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素(rVVC)并行SDS-PAGE電泳及Western-blot驗(yàn)證。純化后的蛋白以透析法進(jìn)行復(fù)性和濃縮。采用BCA(bicinchoninicacid)法進(jìn)行蛋白定量,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出蛋白濃度。 2.2創(chuàng)傷弧菌主動(dòng)免疫預(yù)防的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:SPF級(jí)BALB/c小鼠54只,雌雄不拘,隨機(jī)分為創(chuàng)傷弧菌菌體抗原組(簡稱菌體抗原組)、溶細(xì)胞毒素蛋白抗原組(簡稱蛋白抗原組)、生理鹽水對(duì)照組(簡稱對(duì)照組)各18只。 (2)抗原制備:創(chuàng)傷弧菌菌體抗原,新鮮培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌以0.3%甲醛滅活24h,無菌試驗(yàn)合格后4℃保存;創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素蛋白抗原,rVVC與完全弗氏佐劑/不完全弗氏佐劑等體積乳化制成。 (3)免疫方案:小鼠皮下多點(diǎn)注射,創(chuàng)傷弧菌菌體抗原組小鼠接種菌體抗原:1×10~8個(gè)/只/次;溶細(xì)胞毒素蛋白抗原組小鼠接種蛋白抗原50μg/只/次;生理鹽水對(duì)照組小鼠接種生理鹽水:0.2ml/只/次,0d、首次免疫14d后每10d加強(qiáng)一次。 (4)小鼠免疫學(xué)指標(biāo):免疫接種3-6次后,每組3只小鼠取外周血行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中淋巴細(xì)胞亞群比例;每組6只小鼠,取脾及胸腺,稱重,MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率;血清凝集試驗(yàn)及間接ELISA法檢測(cè)特異性抗體及IgG效價(jià)。 (5)創(chuàng)傷弧菌攻擊試驗(yàn):3組小鼠按上述方法免疫接種6次后,12只/組,75%酒精棉球消毒右下腹皮膚后腹腔注射新鮮培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌ATCC27562懸液,0.5ml/只,細(xì)菌濃度約為10~7-10~8cfu/ml。監(jiān)測(cè)所有小鼠一般情況,包括呼吸、精神狀態(tài)、毛發(fā)、體溫等。小鼠死亡后立即解剖,存活小鼠于注射活菌后48h或10d斷椎法處死,取其主要臟器及組織固定、石蠟包埋后按常規(guī)方法制片、HE染色,光鏡下觀察其病理變化。同時(shí)取心臟內(nèi)血液或血凝塊進(jìn)行Vv分離培養(yǎng)及生化鑒定。 結(jié)果 1.創(chuàng)傷弧菌抗性實(shí)驗(yàn) 1.1創(chuàng)傷弧菌ATCC27562生化特性符合創(chuàng)傷弧菌的生化鑒別特征,生化條鑒定結(jié)果:創(chuàng)傷弧菌%id=99.9(機(jī)讀結(jié)果顯示為“非常好的鑒定結(jié)果”)。 1.2創(chuàng)傷弧菌紫外線抗性研究 創(chuàng)傷弧菌ATCC27562在強(qiáng)度值達(dá)90μW/cm~2的紫外線照射,15min后定性培養(yǎng)為陰性,定量檢測(cè)1min平均滅活對(duì)數(shù)值(LIV)懸液法為4.37±0.13、平板法為5.10±0.19,平均殺菌率懸液法為(99.99±0.01)%、平板法為(99.99±0.05)%,照射15min后無菌存活。 1.3創(chuàng)傷弧菌對(duì)3種消毒劑抗性研究 戊二醛對(duì)創(chuàng)傷弧菌的MIC為0.31g/L,MBC為10.00g/L;過氧乙酸對(duì)創(chuàng)傷弧菌的MIC為0.04g/L,MBC為0.31g/L;乙醇對(duì)創(chuàng)傷弧菌的MIC為4.69%,MBC為37.50%。20g/L戊二醛作用10s、5g/L過氧乙酸作用10s、75%乙醇作用60s均能有效殺滅創(chuàng)傷弧菌。 2.創(chuàng)傷弧菌主動(dòng)免疫預(yù)防動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 2.1創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素的表達(dá)、提取、純化及鑒定 藍(lán)白斑篩選LB平板上長有白色及藍(lán)色的單克隆細(xì)菌斑,其中白色菌落為帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌,即陽性克隆。挑取白色菌斑培養(yǎng),進(jìn)行質(zhì)粒提取,并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增vvhA基因,瓊脂糖電泳獲得相應(yīng)大小目的條帶(vvhA:1356bp)。SDS-PAGE電泳顯示陽性克隆重組大腸桿菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng),能表達(dá)融合蛋白rVVC,在凝膠上70KD的位置可見相應(yīng)蛋白條帶。rVVC經(jīng)透析復(fù)性、濃縮后,BCA法測(cè)定蛋白濃度為2.542mg/ml。Western-blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物rVVC能與抗6×His組氨酸單克隆抗體特異結(jié)合。 2.2小鼠免疫學(xué)指標(biāo) (1)小鼠脾、胸腺重量檢測(cè)結(jié)果 蛋白抗原組小鼠脾重量較對(duì)照組為高(P=0.004),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;菌體抗原組小鼠脾重量與對(duì)照組比較,P=0.919,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。菌體抗原組、蛋白抗原組與對(duì)照組小鼠胸腺重量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (2)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率檢測(cè)結(jié)果 菌體抗原組小鼠ConA刺激的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、LPS刺激的B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率較對(duì)照組高(P=0.018、P=0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其Vv刺激的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率較對(duì)照組高,但差異不具有顯著性(P=0.216);蛋白抗原組小鼠ConA刺激的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、LPS刺激的B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及rVVC刺激的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與對(duì)照組比較,差異均無顯著性。 (3)小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果 三組小鼠外周血的CD19~+ B淋巴細(xì)胞百分比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03),菌體抗原組、蛋白抗原組均高于對(duì)照組。三組小鼠外周血的CD4~+T細(xì)胞及CD8~+T細(xì)胞之百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CD4~+/CD8~+比值差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (4)血清凝集試驗(yàn)結(jié)果 第3次免疫后,菌體抗原組與蛋白抗原組小鼠血清與菌體懸液混合,呈現(xiàn)流沙樣陽性反應(yīng);對(duì)照組小鼠血清、生理鹽水與菌體懸液混合均為陰性結(jié)果。 (5)小鼠血清抗體IgG效價(jià)測(cè)定結(jié)果 第5次加強(qiáng)免疫后,取小鼠血液行間接ELISA檢測(cè)血清抗菌體/rVVC蛋白IgG效價(jià),菌體抗原組血清抗菌體效價(jià)最高達(dá)1:25600,蛋白抗原組血清抗rVVC效價(jià)最高達(dá)1:25600。以各組血清最高稀釋度取對(duì)數(shù)值1g行兩獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn),結(jié)果表明:菌體抗原組小鼠抗菌體IgG效價(jià)高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;蛋白抗原組小鼠抗rVVC蛋白IgG效價(jià)高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (6)Western-blot檢測(cè)結(jié)果 將純化復(fù)性后的rVVC經(jīng)SDS-PAGE后,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,以鼠抗rVVC血清為一抗進(jìn)行Western-blot反應(yīng),結(jié)果顯示rVVC能與免疫血清特異性結(jié)合,在相應(yīng)大小處(約70KD)出現(xiàn)了特異性反應(yīng)區(qū)帶。 2.3創(chuàng)傷弧菌攻擊試驗(yàn)結(jié)果 (1)小鼠一般情況 生理鹽水對(duì)照組注射菌液后36h內(nèi)10只小鼠死亡,2只小鼠存活,存活率為16.7%;其中一只小鼠左后肢出現(xiàn)膿腫、破潰及潰瘍形成,后肢活動(dòng)明顯受限。菌體抗原組及蛋白抗原組小鼠注射菌液后出現(xiàn)毛發(fā)豎立、進(jìn)食減少、蜷縮少動(dòng)等情況,但均較對(duì)照組為輕,48b內(nèi)小鼠均存活,存活率為100%。菌體抗原組及蛋白抗原組小鼠48h存活率均高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組小鼠血培養(yǎng)為陽性,還原鑒定為創(chuàng)傷弧菌。菌體抗原組及蛋白抗原組小鼠注射菌液后48h血培養(yǎng)為陽性,10d培養(yǎng)為陰性。 (2)病理改變 生理鹽水對(duì)照組死亡小鼠各臟器組織充血淤血病變嚴(yán)重,局部見中性粒細(xì)胞浸潤;存活小鼠各組織基本正常,其中一只后肢皮膚潰瘍形成、軟組織呈蜂窩織炎改變。菌體抗原組及蛋白抗原組48h處死小鼠各臟器組織輕度淤血,可見炎細(xì)胞浸潤;10d處死小鼠:蛋白抗原組肝組織局部細(xì)胞灶狀、片狀壞死,呈膿腫樣改變;其余各組織基本正常。 結(jié)論 1創(chuàng)傷弧菌ATCC27562對(duì)紫外線敏感,屬紫外線低度抗性菌;90μW/cm~2的紫外線能有效滅殺創(chuàng)傷弧菌ATCC27562,20g/L戊二醛、5g/L過氧乙酸、75%乙醇能將其迅速有效滅活。 2創(chuàng)傷弧菌菌體抗原、創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素蛋白抗原能有效刺激、增強(qiáng)BALB/c小鼠特異性體液免疫功能,產(chǎn)生創(chuàng)傷弧菌菌體抗體及創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素蛋白抗體,使小鼠獲得有效的免疫保護(hù),可作為創(chuàng)傷弧菌的候選疫苗進(jìn)一步研究。 3致死量創(chuàng)傷弧菌侵犯BALB/c小鼠,小鼠體內(nèi)創(chuàng)傷弧菌菌體抗體、溶細(xì)胞毒素蛋白抗體不能完全將其殺滅,能有效減輕其毒性作用,明顯提高小鼠生存率,降低致殘作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R516;R392

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1351036