本文關(guān)鍵詞：肉毒毒素及炭疽SFV復(fù)制子核酸疫苗的研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 肉毒毒素是肉毒梭菌產(chǎn)生的外毒素,是目前已知毒性最強(qiáng)的天然物質(zhì),共有七個血清型(A~G),其中A和B型是人類肉毒中毒的常見型別,同時也是一種重要的生物戰(zhàn)劑。疫苗是預(yù)防肉毒中毒唯一有效的方法,肉毒毒素疫苗的研究對于軍用和民用都具有重要的意義。本實驗室前期工作已獲得了A型肉毒毒素基于SFV復(fù)制子的DNA疫苗,但由于DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平在人類中其效果還是較低,因此需要提高DNA疫苗的免疫原性以滿足實際應(yīng)用的要求。我們從以下幾個方面對其進(jìn)行了優(yōu)化:通過信號肽研究抗原定位對免疫原性的影響,將不同類型的CpG免疫刺激序列引入載體骨架作為內(nèi)源性佐劑;GMCSF基因佐劑通過三種不同方式進(jìn)行遞送;傳統(tǒng)鋁佐劑在新型DNA疫苗上的應(yīng)用,并進(jìn)行了免疫后抗體水平的長期檢測,其中CpG、GM-CSF基因佐劑和磷酸鋁佐劑都是首次報道在肉毒毒素DNA疫苗上進(jìn)行應(yīng)用。 通過免疫小鼠后抗體水平、細(xì)胞免疫水平和細(xì)胞因子的檢測,并最終通過攻毒實驗確定了疫苗及佐劑的保護(hù)效果。本實驗室前期實驗結(jié)果表明A型肉毒毒素復(fù)制子DNA疫苗免疫的小鼠能夠抵抗10~3LD_(50) A型肉毒毒素的攻擊,采取優(yōu)化策略后采用10~4LD_(50) A型肉毒毒素進(jìn)行攻毒,結(jié)果表明經(jīng)過C型CpG優(yōu)化后的復(fù)制子DNA疫苗不但能夠提高免疫小鼠后抗體水平,而且將攻毒后的存活率由25%提高到75%;GM-CSF基因佐劑與Hc基因共表達(dá)的SFV復(fù)制子DNA疫苗免疫小鼠后,將抗體滴度提高兩倍,攻毒后存活率由25%提高到50%;磷酸鋁佐劑與SFV復(fù)制子DNA疫苗混合后免疫小鼠后將抗體滴度提高4倍,攻毒后小鼠存活率由25%提高到75%,且免疫一年后仍具有保護(hù)作用,小鼠存活率為33%。以上實驗證明了通過以上三種優(yōu)化策略能夠使原有SFV復(fù)制子DNA疫苗的免疫原性和保護(hù)作用不同程度的提高,通過觀察抗體水平可至少持續(xù)一年,顯示了優(yōu)化策略的有效性及DNA復(fù)制子疫苗在A型肉毒毒素核酸疫苗研究中的良好的發(fā)展前景。另外三種優(yōu)化策略可針對不同的抗原方便的應(yīng)用于其它靶標(biāo)疫苗的研究,使SFV復(fù)制子疫苗的研究平臺進(jìn)一步得到完善。 肉毒毒素具有多個血清型,在A型肉毒毒素復(fù)制子DNA疫苗的基礎(chǔ)之上,我們又構(gòu)建了含有B型肉毒毒素Hc基因的復(fù)制子DNA疫苗,并進(jìn)行了免疫原性的研究,該疫苗免疫小鼠三次后抗體滴度達(dá)到1:6400,用10~3LD_(50) B型肉毒毒素進(jìn)行攻擊,小鼠存活率為75%,結(jié)果表明SFV復(fù)制子系統(tǒng)具有應(yīng)用于B型肉毒毒素DNA疫苗的潛力,為深入研究B型及多價肉毒毒素疫苗奠定了基礎(chǔ)。 炭疽桿菌(Bacillus anthracis)是一種能形成芽胞的革蘭氏陽性菌,由它感染引起的炭疽病是嚴(yán)重危害人類的一種致死性的重大傳染病,同時它又是一種潛在的生物戰(zhàn)劑,炭疽疫苗的研究對于生物反恐具有重要的意義。PA是炭疽毒素的三大組分之一,是引起機(jī)體免疫應(yīng)答的最有效的免疫原,單獨應(yīng)用沒有毒性,當(dāng)前應(yīng)用的疫苗主要成分是PA。為了使疫苗更安全,同時縮短免疫時間,簡化免疫程序,提高保護(hù)率,DNA疫苗是炭疽疫苗研發(fā)的一個重要方向。由于PA在炭疽免疫中的重要作用,目前大多數(shù)新炭疽疫苗的研究還是集中于PA或PA組分上,我們克隆了PA抗原的第四結(jié)構(gòu)域基因,構(gòu)建了炭疽PA4基因的SFV復(fù)制子DNA疫苗,這是SFV復(fù)制子系統(tǒng)首次應(yīng)用于炭疽疫苗的研究。該疫苗免疫小鼠后具有良好的免疫原性,免疫三次后抗體滴度達(dá)到1:25600。隨后將CpG內(nèi)源性佐劑的優(yōu)化方案應(yīng)用于炭疽PA4復(fù)制子DNA疫苗,三種不同類型的CpG優(yōu)化后的DNA疫苗免疫小鼠后能將抗體滴度提高2-4倍,具有良好的佐劑效果。同時由于重組病毒顆粒疫苗具有很好的應(yīng)用前景,已有進(jìn)入臨床試驗的報道,我們又首次進(jìn)行了基于SFV復(fù)制子的炭疽重組病毒顆粒疫苗的研究�；赟FV復(fù)制子的DNA疫苗既可以單獨使用,又可以與輔助系統(tǒng)共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞,經(jīng)過制備和純化可得到病毒滴度為107-8U/ml的重組病毒顆粒,經(jīng)負(fù)染色在透射電鏡下可見均一的病毒顆粒形態(tài)。含有PA4基因的重組病毒顆粒疫苗在體外可高效感染細(xì)胞,免疫小鼠后能產(chǎn)生特異性的抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng),在免疫三次后能夠產(chǎn)生滴度為1:102400的高滴度抗體,極有潛力作為人用炭疽候選疫苗,為進(jìn)一步研究新型炭疽疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。 總結(jié)以上的實驗結(jié)果,本研究采用了三種優(yōu)化策略對肉毒毒素SFV復(fù)制子DNA疫苗進(jìn)行了有效的優(yōu)化,并在A、B型肉毒毒素Hc基因及炭疽PA4基因的SFV復(fù)制子DNA疫苗和重組病毒顆粒疫苗上取得了較好的結(jié)果和進(jìn)展,不僅為下一步深入研制肉毒毒素和炭疽新型疫苗奠定了良好的基礎(chǔ),同時也為多價疫苗的研究及其他毒素、細(xì)菌和病毒等疫苗的研究提供了技術(shù)平臺。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1348857