發(fā)布時間：2017-12-28 22:33

  本文關(guān)鍵詞：人胚胎干細胞的優(yōu)化培養(yǎng)以及向神經(jīng)干細胞的分化研究　出處：《華中科技大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 本實驗分三部分解決兩株中國人胚胎干細胞優(yōu)化培養(yǎng)的問題，并將純化的干細胞高效誘導(dǎo)為神經(jīng)干細胞。在實驗過程中對相關(guān)實驗條件和技術(shù)問題進行探索。 第一部分人胚胎干細胞在永生化人成體成纖維細胞飼養(yǎng)層上的培養(yǎng) 目的用永生化的人成體成纖維細胞(HAFi)作為飼養(yǎng)層取代小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)培養(yǎng)兩株中國人胚胎干細胞(hESC)，去除動物源性的細胞混雜。 方法用不同密度的HAFi制備飼養(yǎng)層，，將兩株人胚胎干細胞種植其上。觀察細胞生長情況并繪制HAFi和在此飼養(yǎng)層上的hESC的生長曲線。比較0．05％的胰蛋白酶、1mg／mLⅣ型膠原酶和機械法傳代三種傳代方式對細胞培養(yǎng)的影響。所得干細胞進行基本性質(zhì)的鑒定，并通過流式細胞術(shù)檢測未分化率，MEF為飼養(yǎng)層的培養(yǎng)方式作為對照。 結(jié)果1．HAFi細胞飼養(yǎng)層上兩株中國人胚胎干細胞的生長在形態(tài)學(xué)上與在MEF上的干細胞類似。經(jīng)過鑒定保持了人胚胎干細胞的基本性質(zhì)：AKP染色陽性，未分化標記TRA-1-60、TRA-1-81檢測均為強陽性，OCT-4表達陽性，核型正常。 2．hESC在HAFi飼養(yǎng)層的未分化率與MEF飼養(yǎng)層接近，流式細胞檢測未分化SSEA-4陽性細胞分別為90．467％±0．907和92．1％±0．82，細胞增殖速度也類似，均7天傳代一次。 3．HAFi細胞飼養(yǎng)層的密度對兩株中國人胚胎干細胞的生長和分化率有較大影響。6×10~5／mL的細胞密度為最佳密度，可以保持干細胞較低的分化率和較高的增殖速度。所用密度高于國外報道。 4．Ⅳ型膠原酶法傳代是兩株人胚胎干細胞在HAFi飼養(yǎng)層傳代的最佳方式。操作簡單、污染幾率小、對細胞的生長影響也較低，不足之處在于會攜帶部分飼養(yǎng)層細胞同時傳代。 結(jié)論HAFi細胞可以用做兩株中國人胚胎干細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層，取代MEF后解決了動物源性細胞混雜和異源污染問題，省卻了飼養(yǎng)層原代細胞的培養(yǎng)步驟同時解決了由不同批次飼養(yǎng)層差異帶來的培養(yǎng)體系的不穩(wěn)定。本實驗還初步提示了兩株中國人胚胎干細胞與歐美國家建系的干細胞有所不同。 第二部分人胚胎干細胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的建立與鑒定 目的建立兩株中國人胚胎干細胞無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系，從根本上純化干細胞。 方法用基質(zhì)膠(Matrigel)作為細胞外基質(zhì)。分別使用MEF和HAFi飼養(yǎng)層上清獲得的條件培養(yǎng)基(MEF-CM，HAFi-CM)，添加TGFβ_1、Noggin和不同濃度bFGF的單因子非條件培養(yǎng)基以及FT、FTN、FTNI、TNI等多因子聯(lián)合非條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。觀察細胞在不同無飼養(yǎng)層體系的生長情況，用流式細胞術(shù)檢測細胞分化率，統(tǒng)計細胞傳代周期，從而對不同的無飼養(yǎng)層體系和因子作用做出評估；比較不同MEF飼養(yǎng)層密度獲得的MEF-CM以及不同的傳代方法對干細胞生長的影響；對所得干細胞進行基本性質(zhì)的鑒定。 結(jié)果1．兩株中國人胚胎干細胞可以在MEF-CM、FM160、FM250以及FT、FTN、FTNI等多因子聯(lián)合培養(yǎng)基與基質(zhì)膠共同構(gòu)建的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中生長。 2．6×10~5／mL—12×10~5／mL的MEF飼養(yǎng)層密度適合獲取MEF-CM。 3．機械法傳代可以用于hESC從飼養(yǎng)層到無飼養(yǎng)層的轉(zhuǎn)移步驟，Ⅳ型膠酶法傳代可以用于無飼養(yǎng)層的長期傳代。 4．流式細胞檢測未分化率MEF-CM＞FTNI≈FTN＞FT＞FM160≈FM250＞TNI 5．傳代周期TNI＞FTN＞FT＞FM160≈FTNI＞FM250＞MEF-CM 6．經(jīng)過鑒定兩株中國人胚胎干細胞在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中保持了人胚胎干細胞的基本性質(zhì)。 結(jié)論：通過本部分實驗，我們成功建立了兩株中國人胚胎干細胞的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系。FTNI是我們發(fā)現(xiàn)的適合于兩株中國人胚胎干細胞的最佳非條件培養(yǎng)基因子組合，國外也尚未見同樣的因子組合的報道。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的建立為純化細胞提供了可行的方法并為下一步實驗室和臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。 第三部分純化的人胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞的誘導(dǎo)分化 目的探尋用純化的人胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞分化的最佳誘導(dǎo)方法。 方法用兩種不同的方法：經(jīng)擬胚體途徑誘導(dǎo)和直接誘導(dǎo)法進行干細胞誘導(dǎo)。經(jīng)擬胚體途徑誘導(dǎo)法：先獲得大量的擬胚體，擬胚體打散貼壁后用誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)，消化后懸浮擴增培養(yǎng)。直接誘導(dǎo)法：純化的干細胞消化成合適的細胞團塊，用神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)5-6天，然后使細胞團貼壁繼續(xù)培養(yǎng)16-20天，0．05％胰蛋白酶消化成細胞團后神經(jīng)干細胞擴增培養(yǎng)基重新懸浮擴增培養(yǎng)。 結(jié)果1用純化的hESC可以簡單高效的獲得大量擬胚體 2經(jīng)擬胚體誘導(dǎo)途徑獲得的神經(jīng)干細胞，流式細胞檢測nestin陽性細胞比例為：51．7％±1．70；直接誘導(dǎo)法獲得的神經(jīng)干細胞，流式細胞檢測nestin陽性細胞比例為88．83％±3．40；兩種方法所得神經(jīng)干細胞均可分化成GFAP或MAP2陽性的各種成熟神經(jīng)細胞。 結(jié)論經(jīng)擬胚體誘導(dǎo)途徑的誘導(dǎo)方法是相對廉價的誘導(dǎo)方法，但在技術(shù)上還需進一步突破。以NeuroBasal Medium為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加bFGF、noggin、B27、N2、ITS+1等與基質(zhì)膠聯(lián)合構(gòu)成的誘導(dǎo)體系耗時短、效率高，可以作為一種高效誘導(dǎo)體系推廣。
[Abstract]:The experiment is divided into three parts to solve the problem of optimizing the culture of two Chinese human embryonic stem cells, and the purified stem cells are efficiently induced into neural stem cells. In the process of experiment, the relevant experimental conditions and technical problems are explored.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：1347732