本文關(guān)鍵詞：蝙蝠攜帶冠狀病毒的分子流行病學(xué)研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 研究背景和目的 SARS爆發(fā)后,蝙蝠作為多種人獸共患病病毒的自然宿主越來(lái)越引起人們的重視。 1.蝙蝠種類多,分布廣 蝙蝠隸屬翼手目(Chiroptera),是哺乳類中分布最廣、數(shù)量最多的動(dòng)物之一,全世界大約有17科180屬,約960種,其中我國(guó)有7科29屬107種。翼手目分兩個(gè)亞目:大蝙蝠亞目(Megachiroptera),又稱狐蝠,我國(guó)有1科5屬7種;小蝙蝠亞目(Microchiroptera),即通常所說(shuō)的蝙蝠,我國(guó)有6科24屬100種。 除南北極外,蝙蝠在世界各地都有分布,包括在高緯度地區(qū)、荒涼的沙漠和孤立的島嶼上,甚至在撒哈拉大沙漠也有蝙蝠的活動(dòng)。然而,大多數(shù)蝙蝠種類生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)。蝙蝠物種豐富,分布廣泛,壽命長(zhǎng),并有很強(qiáng)的飛行能力,其中一些蝙蝠種類還有長(zhǎng)途遷移的習(xí)性。 蝙蝠與人類接觸密切。有些蝙蝠就棲息在屋檐下,或是房屋的裂縫中;另外蝙蝠在覓食時(shí)經(jīng)常會(huì)誤闖入居民家中;一些旅游景點(diǎn)的巖洞中也居住有蝙蝠。在中醫(yī)里面,菊頭蝠的糞便被做成“夜明沙”用于治療眼疾;在廣東,果蝠被一些餐館作為野味擺上餐桌;湖南一些地區(qū)則相信蝙蝠可以用來(lái)治療癲癇。 2.蝙蝠與冠狀病毒 2002～2003年爆發(fā)的SARS,在確定SARS冠狀病毒(SARS-CoV)的動(dòng)物源性后,香港大學(xué)微生物系和中科院的研究人員分別發(fā)表文章宣布從菊頭蝠科的蝙蝠中檢測(cè)出蝙蝠SARS樣冠狀病毒(Bat-SARS CoV),與人SARS冠狀病毒的核苷酸同源性＞88%,并且從菊頭蝠科的成員中檢出很高的抗體陽(yáng)性率。因此,研究人員將冠狀病毒的自然宿主鎖定在蝙蝠上,并對(duì)野生蝙蝠展開了一系列的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),蝙蝠所攜帶的冠狀病毒基因多樣性極其豐富,迄今為止已經(jīng)從蝙蝠中發(fā)現(xiàn)了十幾種新的冠狀病毒。但是通過(guò)對(duì)冠狀病毒與宿主受體結(jié)合的S蛋白基因編碼區(qū)的同源性分析表明,bat-SARS CoV與SARS-CoV S基因的同源性僅為64%,因此,SARS-CoV的直接祖先還未被發(fā)現(xiàn),其從感染動(dòng)物宿主到感染人宿主的進(jìn)化歷程還沒(méi)有完全搞清楚,對(duì)已發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒進(jìn)行的系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明還有更多新的冠狀病毒沒(méi)有被發(fā)現(xiàn),現(xiàn)在已知的可能只是自然界中的冠狀病毒一個(gè)很小的子集。 鑒于蝙蝠攜帶冠狀病毒基因型多態(tài)性豐富,以及蝙蝠的生態(tài)學(xué)特性,期望從中發(fā)現(xiàn)其他與SARS-CoV更為同源的冠狀病毒,描繪出病毒在自然宿主中的詳細(xì)進(jìn)化歷程,有助于預(yù)防和控制SARS的再次爆發(fā)流行。因此,我們從海南、廣東和湖南省部分地區(qū)收集蝙蝠標(biāo)本,利用免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)蝙蝠攜帶冠狀病毒進(jìn)行一次初步的分子流行病學(xué)調(diào)查。 研究方法 1.蝙蝠標(biāo)本的收集和處理 2007年5月至8月之間,在海南、廣東和湖南省部分地區(qū)共收集蝙蝠468只,進(jìn)行編號(hào)后,請(qǐng)廣州大學(xué)生命科學(xué)院蝙蝠研究專家吳毅教授進(jìn)行鑒定。采集蝙蝠的地方主要有廢棄的房屋,或者房屋的縫隙、屋檐,以及野外陰濕的山洞。 ①血清的采集。主要用兩種方法,后肢靜脈采血和心臟采血。采集的血樣4℃靜置5h后,3000r/min離心10min,取上清,裝在EP管中,編號(hào),4℃運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室,立即檢測(cè)。 ②直腸樣本的處理。通過(guò)無(wú)菌操作解剖蝙蝠,取肛門上端直腸組織標(biāo)本約2～3cm,保存在含有RNA1ater的凍存管中,4℃運(yùn)輸,回實(shí)驗(yàn)室后,立即檢測(cè)或放入-70℃保存。 2.蝙蝠血清冠狀病毒抗體的SPA-ELISA檢測(cè) ①利用葡萄球菌A蛋白(Staphylococcus protein A,SPA)能夠天然地與人及某些哺乳動(dòng)物的IgG分子上的Fc片段結(jié)合的特性,建立了一種新的SPA-ELISA方法,用于檢測(cè)蝙蝠血清冠狀病毒抗體; ②利用建立的SPA-ELISA對(duì)海南、廣東和湖南部分地區(qū)收集的蝙蝠血清進(jìn)行檢測(cè)。 3.蝙蝠腸道冠狀病毒的RT-PCR檢測(cè) ①參考文獻(xiàn),以及對(duì)已知的冠狀病毒序列進(jìn)行比對(duì),找到冠狀病毒的保守序列設(shè)計(jì)引物。引物擴(kuò)增的目的基因位于RNA依賴的RNA多聚酶編碼區(qū),能夠擴(kuò)增已知的大部分冠狀病毒,包括蝙蝠冠狀病毒; ②利用RT-PCR檢測(cè)蝙蝠直腸樣本中的冠狀病毒。 4.測(cè)序和基因分析 ①對(duì)于擴(kuò)增獲得的目的基因進(jìn)行測(cè)序; ②測(cè)序結(jié)果利用GeneBank的BLAST軟件進(jìn)行在線同源性分析; ③在GeneBank下載其他冠狀病毒序列,利用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)分析; ④用MEGA 4.0軟件,采用Neighbor-Joining法,Jukes-Cantor模型做進(jìn)化樹分析。 5.質(zhì)量控制 ①槍頭、EP管、凍存管、手套等實(shí)驗(yàn)耗材均為一次性用品; ②逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程采用的槍頭、EP管和研磨器用DEPC處理,高溫高壓消毒,烤干后待用,以去除RNA酶污染; ③RNA的提取,RT-PCR的反應(yīng)體系的試劑加樣均在無(wú)菌間生物安全Ⅱ級(jí)超凈臺(tái)進(jìn)行操作,防止環(huán)境中RNA酶的污染; ④操作過(guò)程中,全程戴口罩、帽子,勤換手套,防止樣本和試劑受到來(lái)自操作者攜帶的RNA酶污染; ⑤在RNA提取,RT-PCR,SPA-ELISA過(guò)程中均設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。 三、研究結(jié)果 1.蝙蝠的基本情況 本次研究在海南、廣東和湖南3個(gè)省共收集蝙蝠468只,包括4個(gè)科,12個(gè)種。共收集血清樣本274份,直腸樣本468份。 2.蝙蝠血清冠狀病毒抗體的檢測(cè)情況 ①建立的SPA-ELISA檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)便,檢出濃度低,即使在野外的條件下也可以通過(guò)顏色的變化來(lái)簡(jiǎn)單判定結(jié)果;而且需要的血清量小,完全可以在不傷害動(dòng)物的情況下完成檢測(cè); ②利用SPA-ELISA從采集的274份血清樣本中檢測(cè)出36份陽(yáng)性,陽(yáng)性率為13.14%(36/274)。冠狀病毒抗體檢出自4種蝙蝠,分別為普通長(zhǎng)翼蝠20.45%(27/132),中華菊頭蝠11.11%(2/18),中菊頭蝠9.26%(5/54),棕果蝠3.64%(2/55)。 3.蝙蝠腸道冠狀病毒的檢測(cè)情況 利用RT-PCR,從13份蝙蝠直腸樣本中擴(kuò)增獲得目的基因片段,總陽(yáng)性率為2.78%(13/468)。13份樣本全部來(lái)自湖南省,包括2個(gè)科的4種蝙蝠。其中4份樣本檢出自普通長(zhǎng)翼蝠,陽(yáng)性率2.63%(4/152);6份樣本檢出自中菊頭蝠,陽(yáng)性率3.85%(6/156);2份樣本檢出自中華菊頭蝠,陽(yáng)性率6.90%(2/29);1份樣本來(lái)自小菊頭蝠,陽(yáng)性率16.67%(1/6)。 4.測(cè)序和基因分析結(jié)果 ①BLAST同源性比對(duì)結(jié)果,從普通長(zhǎng)翼蝠檢出2種冠狀病毒bat-CoV HKU7與bat-CoV 1A;從中菊頭蝠和中華菊頭蝠中都檢測(cè)出2種冠狀病毒,bat-CoVHKU2與bat-SARS-CoV;從小菊頭蝠中檢出bat-SARS-CoV; ②用軟件Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)分析和MAGA 4.0構(gòu)建進(jìn)化樹表明冠狀病毒的基因多態(tài)性豐富,3種屬于冠狀病毒group 1,1種屬于group 2。 結(jié)論 ①建立了的蝙蝠血清冠狀病毒抗體SPA-ELISA檢測(cè)方法; ②湖南地區(qū)的蝙蝠可攜帶冠狀病毒,血清冠狀病毒抗體陽(yáng)性率為13.14%(36/274),直腸冠狀病毒陽(yáng)性率2.78%(13/468); ③與之前在中國(guó)其他地方蝙蝠中分離出的冠狀病毒基因型相似,但來(lái)自不同的蝙蝠種類;第一次從中菊頭蝠中檢測(cè)到bat-CoV HKU2,第一次從普通長(zhǎng)翼蝠中檢測(cè)到bat-CoV HKU7,第一次從小菊頭蝠和中菊頭蝠檢測(cè)到bat-SARS-CoV; ④通過(guò)基因分析發(fā)現(xiàn),不同的蝙蝠種類攜帶不同基因型的冠狀病毒,來(lái)自不同地方的同種蝙蝠攜帶的冠狀病毒基因型相似; ⑤檢測(cè)出的病毒基因多態(tài)性豐富,但SARS-CoV的直接祖先仍未被發(fā)現(xiàn)。
[Abstract]:Background and purpose of research
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R181.3;R373

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙衛(wèi);龍北國(guó);張文炳;;SARS冠狀病毒的起源研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)通報(bào);2006年03期

2 李文東,梁國(guó)棟,梁冰,胡志紅,石正麗,張樹義;蝙蝠攜帶病毒的研究進(jìn)展[J];中國(guó)病毒學(xué);2004年04期

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本文編號(hào)：1346750