本文關鍵詞：Fas-AD誘導Bel-7402細胞凋亡的信號轉導機制　出處：《中國醫(yī)科大學》2008年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 抗-Fas抗體 放線菌素D P38MAPK caspase-8 caspase-3 Bcl-2 RB 凋亡 免疫沉淀

【摘要】： 目的 Fas也稱Apo-1或CD95,是腫瘤壞死因子(TNFR)/神經生長因子受體(NGFR)家族的一個代表,在生理和病理的凋亡過程中廣泛涉及,如腫瘤監(jiān)視、免疫功能、爆發(fā)性肝炎和神經再生等。Fas曾經在抗癌治療中被使用,然而在治療應用上Fas受到很大限制,這是由于它的毒性和激活NF-κB家族轉錄因子,NF-κB易引起炎癥和抗凋亡的作用。在體外,為了克服這些問題,特殊的NF-κB抑制劑、轉錄和蛋白合成抑制劑放線菌素D被應用,通過放線菌素D(actinomycin D,AD)處理細胞,使對Fas抗體介導的凋亡不敏感的細胞株變得敏感,這是由于放線菌素D能激活細胞內信號,在誘導凋亡過程中提供了與Fas協(xié)同的共刺激信號,從而促進細胞凋亡。 凋亡或程序性死亡在胚胎形成和發(fā)展中是重要的現(xiàn)象,它維持著機體的自我平衡。對于敏感細胞,當Fas受體與Fas配體或可溶性Fas抗體相結合時,Fas受體三聚化作用導致細胞凋亡。對于Fas抗體誘導細胞凋亡的分子機制已經進行了初步的研究,在Fas-AD誘導的細胞凋亡過程中可以激發(fā)多個信號途徑,其中以caspase蛋白激酶執(zhí)行細胞有秩序的死亡而聞名。 在哺乳動物細胞,凋亡是以依賴線粒體途徑和非依賴線粒體途徑兩條途徑促進細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在調節(jié)線粒體凋亡途徑中起到一個中心作用。Bcl-2家族蛋白的作用位點主要在線粒體膜上,能刺激線粒體細胞色素C的釋放,細胞色素C與Apaf-1一起激活caspase-9,caspase-9激活caspase-3隨之導致凋亡。對于非依賴線粒體途徑:主要通過死亡受體(Fas associated death domain,FADD)作用激活caspase-8,進而激活下游的caspase-3,從而引起細胞凋亡。caspase-8除了直接激活caspase-3外,還可以通過內質網通路間接激活caspase-3。 在兩個途徑中,最后步驟涉及到依靠大量的多蛋白復合體caspase從鈍化的形式變?yōu)榧せ钚问?一旦激活,caspase斷裂各種底物導致細胞死亡,在此過程中caspase-8是頂端的caspaLse,對于啟動Fas誘導的凋亡是非常重要的。在caspase亞家族中,對于理解凋亡,caspase-3由于其易變底物的特殊性而尤其重要。 RB腫瘤抑制蛋白在通過G_1/S調控點調節(jié)細胞周期中起主導作用,參與細胞周期的調節(jié)。通常認為失活的RB在G_1/S臨界點通過磷酸化釋放E_2F轉錄因子誘導細胞周期基因表達,加速S期進入引起細胞增殖。RB還有很多其他的細胞功能,包括介導分化的信號,在有絲分裂過程中調節(jié)染色體分離,維持基因的完整性。擾亂這些RB功能的途徑能潛在的引起增殖的增高或基因的不穩(wěn)定導致腫瘤的發(fā)生。 有絲分裂原蛋白激酶已經被暗示是凋亡的上游信號,包括ERK1/2、JNK、p38和ERK5亞家族。在哺乳動物細胞,它們是由不同的外界刺激物(如紫外線和滲透性刺激等)調節(jié)的獨立模型,通過傳導不同信號導致細胞的增殖、分化和凋亡。在死亡受體誘導凋亡的過程中,這個途徑的作用還不太清楚,可能依靠特殊的死亡受體和細胞類型。 目前,關于Fas-AD誘導Bel-7402腫瘤細胞凋亡的過程中,P38MAPK與caspase-8是否一起參與,P38MAPK與caspase家族之間的關系,以及P38MAPK、caspase與Bcl-2、Rb的關系還不清楚,本研究利用Fas-AD誘導Bel-7402細胞凋亡,通過P38MAPK抑制劑SB203580及caspase-8抑制劑Ac-IEFD-cho的作用,來確定P38MAPK、caspase-8、caspase-3及Bcl-2、RB的關系,進一步揭示Fas-AD誘導Bel-7402細胞凋亡的信號轉導機制。 方法 1、通過MTT法檢測Fas-AD作用后的Bel-7402細胞活力,在Fas抗體不同濃度下的不同作用時間點檢測。 2、通過倒置顯微鏡、電子顯微鏡和流式細胞儀檢測Fas、Fas-AD、SB203580(P38MAPK特異性抑制劑)及Ac-IEFD-cho(caspase-8特異性抑制劑)對Bel-7402細胞凋亡的影響。 3、通過Western-blot法、RT-PCR法檢測Fas-AD、SB203580及Ac-IEFD-cho對培養(yǎng)的Bel-7402細胞的P38MAPK、caspase-8、caspase-3的激活作用,對FasR、Bcl-2、RB表達的影響及其可能的信號轉導通路。 4、利用激光共聚焦顯微鏡通過免役熒光法檢測Fas-AD、SB203580及Ac-IEFD-cho作用后P38MAPK與caspase-3的細胞內定位。 5、通過免疫沉淀法確定P38MAPK與caspase-3的作用關系,caspase-3與RB的作用關系及其可能的信號轉導通路。 結果 1、Fas-AD能明顯抑制Bel-7402細胞增殖,且隨Fas抗體濃度及其作用時間呈依賴關系。 2、Fas-AD能明顯誘導Bel-7402細胞凋亡,SB203580和Ac-IEFD-cho能明顯抑制Fas-AD誘導的細胞凋亡。 倒置顯微鏡下觀察顯示,Fas-AD作用24h后能明顯地誘導Bel-7402細胞凋亡,細胞質出現(xiàn)大量空泡,核仁的數(shù)量減少,死亡細胞較多。SB203580和Ac-IEFD-cho分別單獨作用時能改善這種現(xiàn)象,死亡細胞相對較少;當兩個抑制劑共同作用時能明顯改善這種現(xiàn)象,細胞質出現(xiàn)微量小泡,核仁較多。 電子顯微鏡下觀察顯示,Fas-AD作用24h后,Bel-7402細胞出現(xiàn)典型的凋亡特征,細胞體積變小,胞質濃縮,胞漿內空泡增多,染色質固縮、邊集或碎裂成不規(guī)則塊狀,出現(xiàn)凋亡小體。SB203580組和Ac-IEFD-cho組可見細胞膜相結構完整,胞漿內空泡相對減少,染色質邊緣聚集,線粒體腫脹。SB203580和Ac-IEFD-cho共同作用組,未出現(xiàn)明顯的凋亡特征,胞漿可見少量小泡。 Annexin-V FITC/PI雙標流式細胞術分析顯示:Fas-AD作用24h后,與對照組比較Fas-AD組能明顯誘導Bel-7402細胞凋亡,凋亡率為50.55±3.25%,SB203580和Ac-IEFD-cho單獨或共同作用都能明顯的抑制Fas-AD誘導的凋亡。 3、Fas-AD能明顯誘導Bel-7402細胞FasR表達。 Western-blot結果顯示,Fas-AD誘導培養(yǎng)的Bel-7402細胞的FasR表達,并且FasR隨Fas抗體濃度呈劑量依賴性增加,但當Fas抗體濃度為10μM時,FasR表達增加量減緩。 4、P38MAPK與caspase-8參與Fas-AD凋亡途徑,并且相互調節(jié)。 P38MAPK抑制劑SB203580和caspaLse-8抑制劑Ac-IEFD-cho阻礙Fas-AD誘導凋亡的作用明顯顯示,P38MAPK和caSpase-8在Fas-AD誘導的凋亡中起重要作用。 5、在Fas-AD誘導Bel-7402細胞凋亡過程中,通過抑制劑SB203580和Ac-IEFD-cho的作用發(fā)現(xiàn)P38MAPK和caspase-8調節(jié)Bcl-2、Rb的表達,P38MAPK和caspase-8能明顯地降低Bcl-2的表達,增加RB的表達。 6、P38MAPK和caspase-8調節(jié)caspase-3的表達。 Western-blot結果顯示,Fas-AD誘導caspase-3表達并發(fā)生斷裂激活,并且斷裂片段表達隨Fas抗體濃度增加呈劑量依賴性增加,而抑制劑SB203580和Ac-IEFD-cho能明顯地抑制其表達和激活。 7、當Fas-AD作用Bel-7402細胞24h時,在Fas-AD誘導Bel-7402細胞凋亡過程中P38MAPK與caspase-3從細胞質轉位到細胞核形成P38MAPK/caspase-3復合體,而抑制劑SB203580和Ac-IEFD-cho能明顯地抑制他們的轉位。 8、當Fas-AD作用Bel-7402細胞48h時,caspase-3與RB相互作用并形成caspase-3/Pd3復合體。 結論 1、Fas-AD抑制Bel-7402細胞增殖,誘導Bel-7402細胞凋亡。 2、Fas-AD經P38MAPK、caspase-8信號通路誘導Bel-7402細胞凋亡。 3、在Fas-AD誘導Bel-7402細胞凋亡過程中,P38MAPK與caspase-8相互調節(jié),不僅從蛋白總量而且還從激活(磷酸化形式或斷裂形式)的表達上相互影響,再有從mRNA水平也相互調節(jié)。 4、Fas-AD通過激活P38MAPK、caspase-8從而引起caspase-3的激活,作用下游底物Bel-2、RB調節(jié)其表達。 5、在Fas-AD誘導Bel-7402細胞凋亡過程中,P38MAPK與caspase-3從細胞質轉位到細胞核,短暫作用形成P38MAPK/caspase-3復合體,調節(jié)caspase-3的表達,當P38MAPK/caspase-3復合體分離后,caspase-3與RB形成復合體進而調節(jié)RB的表達,從而引起細胞凋亡。
[Abstract]:objective
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R363

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