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p55PIK:慢性炎癥分子干預(yù)新靶點

發(fā)布時間:2017-12-28 00:32

  本文關(guān)鍵詞:p55PIK:慢性炎癥分子干預(yù)新靶點 出處:《華中科技大學(xué)》2010年博士論文 論文類型:學(xué)位論文


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【摘要】: 第一部分P55PIK及其N末端24個氨基酸對LPS誘導(dǎo)下HaCaT細(xì)胞釋放炎性因子的干預(yù)作用 目的: 1.觀察磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的調(diào)節(jié)亞單位—p55PIK氨基端24個氨基酸(N24)對人角質(zhì)形成細(xì)胞株—HaCaT細(xì)胞增殖的影響。 2.觀察不同濃度以及不同時間脂多糖刺激下HaCaT細(xì)胞釋放炎性因子TNF-α的變化。 3.觀察磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的調(diào)節(jié)亞單位p55PIK及其氨基端24個氨基酸對脂多糖刺激HaCaT細(xì)胞釋放細(xì)胞因子TNF-α、IL-6IL-8的影響,為臨床治療工作提供理論依據(jù)。方法: 利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建并表達(dá)純化了含有PI3K-p55PIK-N末端24個氨基酸的TAT-N24融合多肽、腺病毒AD-N24-GFP和含有PI3K-p55PIK的腺病毒AD-p55PIK-GFP,能夠高效的攜帶N24或p55PIK進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。以人角質(zhì)形成細(xì)胞株—HaCaT細(xì)胞為研究對象,以脂多糖(lipopolysaccharides LPS)刺激為主要誘導(dǎo)方式,探索N24對HaCaT細(xì)胞增殖的影響,應(yīng)用CFDA標(biāo)記法檢測細(xì)胞增殖情況;探索LPS的最佳刺激時間和刺激濃度,采用ELISA法、Real time-PCR法檢測N24及p55PIK干預(yù)下TNF-α、IL-6和IL-8蛋白水平及mRNA水平的變化。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建并表達(dá)純化了TAT-N24融合多肽和腺病毒AD-N24-GFP,AD-p55PIK-GFP; TAT-N24能有效阻滯HaCaT細(xì)胞周期進(jìn)程于G0/G1期,S期和G2/M期細(xì)胞減少,TAT-N24組各期細(xì)胞分布為G0/G1期(80.37±1.09)%,S期(7.81±1.97)%,G2/M期(11.82±1.71)%,而對照多肽組各期細(xì)胞分布為:G0/G1期(58.54±2.06)%, S期(26.34±1.69)%, G2/M期(15.12±1.91)%,空白對照組各期細(xì)胞分布為:G0/G1期(60.14±2.06)%,S期(25.32±1.78)%,G2/M期(14.34±1.39)%,組間有顯著性差異(p0.05);BrdU陽性細(xì)胞比例顯示:TAT-N24組R2為:(8.37±2.06)%,對照多肽組R2為:(28.14±4.69)%,空白對照組R2為:(26.73±3.58)%,提示TAT-N24能有效抑制]HaCaT細(xì)胞的DNA合成;CFDA檢測顯示TAT-N24組增殖指數(shù)(PI)為:30.75±3.66,對照多肽組增殖指數(shù)(PI)為:47.81±5.66,空白對照組增殖指數(shù)(PI)為:50.16±5.33,有顯著差異(p0.05)提示TAT-N24能有效抑制]HaCaT細(xì)胞的增殖。 2.成功構(gòu)建LPS刺激下HaCaT細(xì)胞釋放炎性因子的模型。正常狀態(tài)下的HaCaT細(xì)胞有TNF-α、IL-6和IL-8的自發(fā)性分泌;LPS刺激后的HaCaT細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-8的分泌量明顯增加這與銀屑病患者皮損中細(xì)胞因子的變化非常相似。ELISA法確認(rèn)LPS最佳的刺激濃度和刺激時間,使HaCaT細(xì)胞釋放炎性因子TNF-α水平達(dá)到最高。 3.TAT-N24作用于HaCaT細(xì)胞后其TNF-α的分泌量有一定的增加,它們可能參與了對正常皮膚的炎性刺激作用,一定濃度TAT-N24可有效抑制LPS刺激HaCaT細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6和ⅠL-8。ELISA檢測結(jié)果顯示:相對于LPS刺激組,TAT-N24干預(yù)組的細(xì)胞上清內(nèi)TNF-α、IL-6和IL-8的濃度分別由208.06±30.18pg/ml、86.4±9.78pg/ml和260.59±54.05pg/ml下降至121.78±22.26pg/ml、53.18±7.36pg/ml和125.08±35.17pg/ml。real time-PCR結(jié)果顯示:正常HaCaT細(xì)胞可以分泌一定程度的炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8。內(nèi)毒素(LPS)刺激HaCaT細(xì)胞后,炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8的釋放增加,加入TAT-N24干預(yù)后,上述三種促炎因子的表達(dá)降低。而AD-N24-GFP也可以抑制LPS刺激HaCaT細(xì)胞釋放炎性因子(TNF-α、IL-6和IL-8)的表達(dá),其作用和TAT-N24功能類似;AD-p55PIK-GFP自身也可以導(dǎo)致炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8的釋放增加,加入LPS刺激后,炎性因子的釋放增加,與空白對照組及無AD-p55PIK-GFP干預(yù)下LPS刺激組比較,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 4.real time-PCR法檢測結(jié)果顯示:正常HaCaT細(xì)胞有一定程度的TNF-α、IL-6和IL-8mRNA的表達(dá),LPS刺激后,上述三種炎性因子有不同程度的升高。HaCaT細(xì)胞經(jīng)TAT-N24和AD-N24-GFP預(yù)先處理過后,LPS刺激下炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8相對于未預(yù)先處理組mRNA水平表達(dá)降低;感染AD-p55PIK-GFP后,HaCaT細(xì)胞在LPS刺激下炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8mRNA水平表達(dá)升高。 第二部分p55PIK及其N末端24個氨基酸調(diào)控LPS誘導(dǎo)下HaCaT細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)的機制研究 目的: 探討N24及p55PIK在HaCaT細(xì)胞內(nèi)對TLR2、TLR4及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控機制。 方法: 免疫組化檢測NF-κB P65在HaCaT細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況;免疫熒光激光共聚焦顯微鏡分析NF-κB P65在HaCaT細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)位表達(dá)情況;Western Bloting檢測分析AD-N24-GFP及AD-p55PIK-GFP干預(yù)后,LPS刺激下HaCaT細(xì)胞內(nèi)TLRs信號通路蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果: 1、免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果提示正常HaCaT細(xì)胞內(nèi)NF-KB P65蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi),低染,LPS刺激后P65蛋白轉(zhuǎn)位入核,在核內(nèi)表達(dá)增加,高染;感染AD-N24-GFP后NF-κB P65在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)降低。 2、免疫熒光后激光共聚焦顯微鏡分析結(jié)果顯示正常HaCaT細(xì)胞內(nèi)NF-κB P65蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi),LPS刺激后NF-κB P65轉(zhuǎn)位入核,在核內(nèi)表達(dá)增加;感染AD-N24-GFP后NF-κB P65蛋白在核內(nèi)的表達(dá)降低。 3、Western Bloting結(jié)果提示LPS刺激下HaCaT細(xì)胞內(nèi)TLRS通路中各蛋白均有不同程度的改變,TLR2、TLR4表達(dá)增加,它們在4小時內(nèi)達(dá)到高峰,隨后逐漸降低,但到24小時仍然高于正常細(xì)胞表達(dá)水平;感染AD-N24-GFP后,其表達(dá)情況未見明顯變化,感染AD-p55PIK-GFP后TLR2及TLR4表達(dá)均增加;MyD88蛋白表達(dá)隨LPS刺激時間的增加而增加,到8小時達(dá)到最高點,然后逐漸下降但24小時內(nèi)仍高于正常水平,感染AD-N24-GFP后MyD88表達(dá)降低,而感染AD-p55PIK-GFP其表達(dá)增加;磷酸化Akt(p-Akt)表達(dá)隨LPS刺激時間增加而增加,在2小時達(dá)到最高峰,以后逐漸降低,到24小時已經(jīng)基本恢復(fù)到正常水平,感染AD-N24-GFP后其表達(dá)情況為未見明顯改變;感染AD-p55PIK-GFP后p-Akt表達(dá)增加;ERKs從30分鐘起磷酸化激活增強(P0.05),4小時達(dá)高峰(P0.05),其后逐漸下降,但直至24小時仍顯著高于基礎(chǔ)水平(P0.05)。JNK/SAPK、p38亦有與ERKs磷酸化激活相同的變化趨勢,所不同的是,JNK/SAPK磷酸化在4h高峰值以后迅速下降(P0.05),至24小時已經(jīng)回復(fù)到基礎(chǔ)水平。p38磷酸化在4h高峰后迅速下降(P0.05),但24小時仍略高于基礎(chǔ)水平(圖2)。感染AD-N24-GFP及AD-p55PIK-GFP后其表達(dá)情況為未見明顯改變;IκB-α于LPS刺激后30分鐘出現(xiàn)表達(dá)降低,到4小時達(dá)到最低點,到16小時開始逐步恢復(fù),但到24小時仍然低于正常水平。感染AD-N24-GFP后,IκB-α表達(dá)相對于LPS刺激組增加;感染AD-p55PIKP后,IKB-α表達(dá)相對于LPS刺激組表達(dá)未見明顯變化。 結(jié)論: AD-N24-GFP及AD-p55PIK-GFP通過干預(yù)TLRs/MyD88介導(dǎo)的信號通路來影響LPS刺激下HaCaT細(xì)胞釋放炎性因子的變化。
[Abstract]:The intervention of 24 amino acids at the first part of P55PIK and its N terminal on the release of inflammatory factors in HaCaT cells induced by LPS
【學(xué)位授予單位】:華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2010
【分類號】:R341

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