本文關鍵詞：人誘導性多能干細胞向神經干細胞分化的實驗研究　出處：《南昌大學》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 目的: 誘導性多能干細胞(Induced Pluripotent Stem cells, iPS細胞)是通過成體細胞重編程技術產生的多能干細胞,具有分化為三個胚層細胞的能力,類似于胚胎干細胞。由于iPS細胞可來自自體的體細胞,其使用可避免胚胎干細胞面臨的倫理及免疫排斥兩大問題,顯示出廣闊的應用前景,為臨床上多種難治性疾病的治療開辟了新的思路。神經系統(tǒng)損傷的修復一直是研究的熱點,利用神經干細胞(Neural stem cells, NSCs)修復或替代受損的神經組織有望成為有效的治療手段。由iPS細胞誘導而來的NSCs可解決NSCs的來源及免疫排斥等問題,具有極大的應用價值。本實驗擬建立穩(wěn)定的人iPS細胞培養(yǎng)體系,為今后iPS細胞的研究和應用提供高質量的研究材料;同時探討體外誘導人iPS細胞向NSCs分化的方法,建立人iPS細胞來源的NSCs(iPS derived NSCs, iPSd-NSCs)培養(yǎng)體系,為iPS細胞應用于神經系統(tǒng)損傷性疾病的治療奠定實驗和理論基礎。 方法: 1.人iPS細胞的傳代培養(yǎng)。人iPS細胞接種于飼養(yǎng)層上,Ⅳ型膠原酶傳代培養(yǎng)。 2.擬胚體(Embryoid body, EB)的制備。消化iPS細胞集落,差速貼壁后懸浮培養(yǎng)4天。 3. iPS細胞向NSCs定向誘導實驗。實驗分自然分化組(將EBs于EB培養(yǎng)基中培養(yǎng));RA誘導組(EBs于含維甲酸(Retinoic acid, RA)的EB培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)4天后,轉移至EB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng));RA+無血清培養(yǎng)基誘導組(EBs于含RA的EB培養(yǎng)基中誘導4天后轉移至無血清培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng))。 4.倒置顯微鏡下觀察iPS細胞的生長情況及誘導過程中各組細胞的形態(tài)變化;RT-PCR檢測iPS細胞中多能性基因Oct4和Sox2的表達;熒光實時定量PCR檢測iPS細胞形成EB后多能性基因的變化及RA誘導后第7天各組細胞Nestin基因的表達;細胞免疫熒光染色法檢測神經相關標志物Nestin、β-tubulinШ和GFAP的表達。 5.收集RA+無血清培養(yǎng)基誘導組篩選獲得的神經球(iPSd-NSCs)繼續(xù)擴增培養(yǎng),每天觀察神經球的增殖情況,拍照記錄并測量球體直徑;檢測神經球的分化能力及單個iPSd-NSC細胞的克隆形成能力。免疫熒光染色法檢測克隆球Nestin及貼壁分化細胞β-tubulinШ和GFAP的表達情況。 結果: 1.人iPS細胞在飼養(yǎng)層細胞上穩(wěn)定傳代,形成致密的克隆,邊界清晰�？寺燃毎帕芯o密,細胞體積小、核大,細胞核/質比高。iPS細胞在多次傳代后仍表達多能性基因Oct4和Sox2;去除飼養(yǎng)層后懸浮培養(yǎng)能形成EBs。與iPS細胞相比,EBs中多能性基因的表達明顯下調。 2. RA誘導后第3天,RA誘導組及RA+無血清培養(yǎng)基誘導組均觀察到了環(huán)形rosette結構,并不斷增多,到第7天均達高峰。RA誘導組rosette結構中有大量Nestin陽性細胞,這些細胞能分化為β-tubulinШ陽性的神經元,但GFAP陽性的星形膠質細胞少見。RA+無血清培養(yǎng)基誘導組rosette細胞易脫離瓶壁懸浮生長,形成神經球樣克隆,克隆折光性強,表面可見新增殖的細胞突起。免疫熒光顯示神經球呈Nestin陽性表達,神經球在含血清培養(yǎng)基中能分化為β-tubulinШ和GFAP陽性的細胞。自然分化組EB貼壁后,周圍爬出成纖維樣細胞,免疫熒光染色見少量Nestin,β-tubulinШ和GFAP陽性細胞。RA誘導后第7天,RA誘導組和RA+無血清培養(yǎng)基誘導組Nestin基因的表達量均明顯高于自然分化組(p0.05),分別為自然分化組的3.71±0.03和7.14±1.96倍;RA+無血清培養(yǎng)基誘導組Nestin基因的表達量亦比RA誘導組高(p0.05),為1.93±0.52倍。同時,免疫熒光結果顯示,自然分化組、RA誘導組和RA+無血清培養(yǎng)基誘導組Nestin陽性細胞率分別為23.77±2.96%、53.25±4.52%和87.54±3.67%,各組間P㩳0.05,差異有統(tǒng)計學意義。 3. iPSd-NSCs在無血清培養(yǎng)基中穩(wěn)定增殖,每6-8天傳代一次,神經球直徑不斷增大;單個細胞培養(yǎng)一周后能形成神經球;在含血清培養(yǎng)基中,iPSd-NSCs能分化成β-tubulinШ陽性的神經元細胞和GFAP陽性的膠質細胞。 結論: 1.人iPS細胞在本實驗室的培養(yǎng)體系下能穩(wěn)定增殖,保持高度自我更新及分化潛能,說明本實驗的培養(yǎng)體系適合人iPS細胞的穩(wěn)定培養(yǎng)。 2. RA能促進iPS細胞向NSCs分化;RA結合無血清培養(yǎng)基篩選法不僅能促進iPS細胞向NSCs分化,同時還能提高iPSd-NSCs的存活及增殖能力,是一種高效獲得NSCs的方法。 3.人iPSd-NSCs在無血清培養(yǎng)基中能穩(wěn)定增殖,多次傳代仍保持未分化狀態(tài)及神經分化潛能,因此,本實驗建立了穩(wěn)定的iPSd-NSCs誘導培養(yǎng)體系,對NSCs定向誘導機制的研究及其臨床應用具有重要意義。
[Abstract]:Objective:
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻】

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1 HSIAO CHIEN TSUNG;The culture and establishment of embryonic germ(EG)cell lines from Chinese mini swine[J];Cell Research;2003年03期

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本文編號：1342304