本文關(guān)鍵詞：人胚胎干細(xì)胞生物學(xué)性狀及向內(nèi)皮分化過程中ID-1基因作用的研究　出處：《山東大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 第一部分由正常和異常原核來源的合子得到的人胚胎干細(xì)胞系生物性狀的比較 目的：人胚胎干細(xì)胞系可建立于正常和異常受精的合子,然而,這兩種類型的人胚胎干細(xì)胞系之間的性狀的異同尚未可知。有文獻(xiàn)報(bào)道雙倍體的人胚胎干細(xì)胞系可以由單原核來源的合子建系得到,但形態(tài)學(xué)為多原核受精的合子是否也可建立正常的人胚胎干細(xì)胞系尚無明確報(bào)道。為了探索這些問題,我們建立了9株人胚胎干細(xì)胞系,分別來源于形態(tài)學(xué)正常(雙原核,2PN)和形態(tài)學(xué)異常(未見原核,0PN單原核,1PN；三原核,3PN)原核的合子。通過深入比較其性狀異同,以期解決以上問題。 方法：建立來源于形態(tài)學(xué)正常和異常原核的受精合子的hES細(xì)胞系及其培養(yǎng)維持。堿性磷酸酶染色及免疫熒光染色檢測(cè)各株細(xì)胞的“干”性,畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體內(nèi)分化能力,RT-PCR分析檢測(cè)體外分化能力。核型分析檢測(cè)各株細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性,DNA質(zhì)譜分析檢測(cè)每株hES細(xì)胞的基因組DNA的特異性。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布情況,BrdU摻入實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞系增殖潛力。實(shí)時(shí)定量PCR分析代表分化及未分化基因的表達(dá)水平。hES細(xì)胞的神經(jīng)定向誘導(dǎo)分化檢測(cè)神經(jīng)分化潛能。 結(jié)果：我們由46個(gè)臨床廢棄的新鮮囊胚建立了9株人胚胎干細(xì)胞系(細(xì)胞株mSDU-hES 1-9),其中5個(gè)為2PN來源,2個(gè)為0PN來源,1個(gè)為1PN來源,1個(gè)為3PN來源。由形態(tài)學(xué)不同原核來源的合子得到的干細(xì)胞系顯示相似的克隆形態(tài),每株細(xì)胞系均能成功凍融,均不存在增殖及自我更新障礙。每一株胚胎干細(xì)胞系均能表達(dá)堿性磷酸酶活性及“干性”標(biāo)記：OCT-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60和TRA-1-81。每隔6個(gè)月進(jìn)行一次的核型分析表明,每一株胚胎干細(xì)胞系具有正常的雙倍體核型,染色體畸變未檢測(cè)到,每株胚胎干細(xì)胞系都有各自獨(dú)特的遺傳特異性標(biāo)記。嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠在接種各株未分化hES細(xì)胞10-12周后經(jīng)解剖證實(shí)均有含有三個(gè)胚層細(xì)胞系的畸胎瘤形成,說明各株干細(xì)胞均具有體內(nèi)分化的全能性。細(xì)胞株mSDU-hES 1-8分化得到的擬胚體能夠表達(dá)OCT4以及代表外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的組織特異性基因,但是細(xì)胞株mSDU-hES 9 (2PN)分化得到的擬胚體僅表達(dá)代表外胚層和中胚層的基因,而并不表達(dá)代表內(nèi)胚層的基因。hES細(xì)胞系的細(xì)胞周期分布呈獨(dú)特的4階段細(xì)胞周期模式,特征為大量細(xì)胞處于S期而小部分細(xì)胞處于Go／G1和G2／M期。與細(xì)胞株mSDU-hES 5(2PN)比較,細(xì)胞株mSDU-hES 2(0PN)顯示有更多的細(xì)胞處于S期,具有較高含量的增殖期細(xì)胞；而1PN和3PN合子來源的hES細(xì)胞系與細(xì)胞株mSDU-hES 5(2PN)具有相似的增殖期細(xì)胞含量。mSDU-hES 2 (OPN)比其它細(xì)胞株具有較短的細(xì)胞周期和較高的增殖率。所檢測(cè)的所有細(xì)胞系均可表達(dá)11種分化及未分化標(biāo)記,但其基因表達(dá)含量各不相同。對(duì)于大多數(shù)未分化的基因OCT4, NANOG, LIN41和SOX2,各株細(xì)胞系間無明顯差異。然而,2PN來源的細(xì)胞株mSDU-hES5中DPPA5的表達(dá)顯著低于其它細(xì)胞系,而3PN來源的mSDU-hES8中UTF1的表達(dá)顯著高于其它細(xì)胞系。各株細(xì)胞系對(duì)于分化基因的表達(dá)也存在較大的差異。這種分化及未分化標(biāo)記基因相對(duì)含量表達(dá)差異在正常的hES細(xì)胞株之間同樣存在。hES細(xì)胞經(jīng)過3周神經(jīng)定向分化的培養(yǎng),來源于形態(tài)學(xué)正常及異常受精合子的干細(xì)胞株均可分化出NESTIN陽性神經(jīng)前體細(xì)胞和TUJ1陽性神經(jīng)元細(xì)胞,且2PN合子來源的hES細(xì)胞株及0PN、1PN、3PN合子來源的hES細(xì)胞株具有相似神經(jīng)分化潛能。 結(jié)論：1.來源于形態(tài)學(xué)上不同原核的合子的9株hES細(xì)胞系具有相似的大致特征。所有9株細(xì)胞表達(dá)相似的“干性”標(biāo)記,包括轉(zhuǎn)錄因子及糖脂分子標(biāo)記物：OCT-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60及TRA-1-81；各株細(xì)胞的增殖能力及在擬胚體和畸胎瘤中分化為外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細(xì)胞系的潛能也具有相似性。在神經(jīng)定向分化條件下,所有的細(xì)胞株均可分化成神經(jīng)前體和神經(jīng)元。2.在細(xì)胞周期和分化及未分化標(biāo)記基因的相對(duì)表達(dá)量等方面存在差異。這些差異在正常來源的不同人胚胎干細(xì)胞系之間也同樣存在。這種現(xiàn)象可能決定于不同細(xì)胞系本身的生物學(xué)特性,而非與形態(tài)學(xué)正常或異常原核來源相關(guān)。3.正常的人胚胎干細(xì)胞系可以由臨床棄用的具有形態(tài)學(xué)異常原核的受精合子建立。 第二部分ID-1基因在TGF-betal誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用探討 目的：分化抑制子／DNA結(jié)合抑制子-1(ID-1)是內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)中活化素受體樣激酶-1(ALK1)的特異性下游基因,它介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)／ALK1誘導(dǎo)的(Smad依賴的)內(nèi)皮細(xì)胞遷移。然而,ID-1基因在TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞向內(nèi)皮分化及血管發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用,尚未有確切的研究報(bào)道。本文以人胚胎干細(xì)胞(hESCs)的體外分化作為血管內(nèi)皮發(fā)育的模型,來研究ID-1基因在TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用。 方法：建立TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及形成血管樣結(jié)構(gòu)的模型,用免疫熒光定性分析不同濃度的TGF-β1對(duì)血管內(nèi)皮定向分化及血管發(fā)生的作用。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)組及對(duì)照組中ID-1基因和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志基因PECAM, KDR的表達(dá)含量,分析TGF-β1對(duì)ID-1基因表達(dá)的影響。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞分化和血管發(fā)生過程中ID-1基因表達(dá)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)。通過小干擾RNA技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析ID-1基因在TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的功能。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和western雜交技術(shù)分析分化和血管發(fā)生過程中TGF-β1受體及信號(hào)分子蛋白表達(dá)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)表達(dá)。 結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)在hESCs分化為ECs早期,TGF-β1能夠通過抑制ID-1基因的表達(dá)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向內(nèi)皮系的定向分化,在分化晚期的血管發(fā)生階段,TGF-β1通過ALK1／Smadl,5／ID-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)ID-1基因的表達(dá)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。但是TGF-β1在血管生成過程中對(duì)于血管出芽卻起抑制作用。另外,TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞過程及ID-1基因的表達(dá)對(duì)于TGF-β1不僅具有時(shí)間依賴性,而且具有濃度的依賴性。通過沉默ID-1基因來降調(diào)該基因的表達(dá)將促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞而抑制分化的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。 結(jié)論：運(yùn)用TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞分化模型,我們分析了在向內(nèi)皮系分化及分化的內(nèi)皮細(xì)胞增殖過程中ID-1基因的功能。我們的數(shù)據(jù)表明,在分化過程中TGF-β1可以通過ALK5通路刺激內(nèi)皮方向的分化,而在增殖過程中則通過TGF-β1/ALK1/ID-1,Smad1/Smad5依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增強(qiáng)分化的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。本研究運(yùn)用人胚胎干細(xì)胞體外分化的模型,有助于我們了解胚胎發(fā)育早期階段體內(nèi)血管形成的部分機(jī)制。通過進(jìn)一步研究該基因的調(diào)控因子,以促進(jìn)或抑制其表達(dá)水平,對(duì)于臨床治療病理性血管生成和促進(jìn)修復(fù)性血管生成有指導(dǎo)借鑒意義。
[Abstract]:Part 1 Comparison of the biological traits of human embryonic stem cell lines obtained from the zygote of normal and abnormal prokaryotic sources
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1341188