本文關鍵詞：內(nèi)毒素血癥過程中組蛋白的甲基化修飾及其對炎癥介質(zhì)的轉錄調(diào)控　出處：《南方醫(yī)科大學》2013年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)感染時,細菌的細胞壁成份-內(nèi)毒素(endotoxin),或稱為脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)被釋放入血。釋放入血的LPS能廣泛作用于免疫細胞產(chǎn)生大量的細胞因子,如腫瘤壞死因子α(TNFα)、白介素6(IL-6)、白介素1(IL-1)、干擾素(INF)、一氧化氮(NO)、血小板活化因子等,即“細胞因子風暴(cytokine storm)",進而引起失控性炎癥級聯(lián)反應,最終引起內(nèi)毒素休克、組織損傷,嚴重時可發(fā)展為多器官功能障礙(mutiple organ dysfunction)。目前,對于內(nèi)毒素血癥的治療方案主要有抗生素、抗內(nèi)毒素抗體、炎性介質(zhì)拮抗劑、傳統(tǒng)中醫(yī)藥以及血液凈化等,但均有不足,如療效并不顯著,或副作用比較大。因此,探索和認識內(nèi)毒素血癥的確切發(fā)病機制和干預措施,對防治內(nèi)毒素休克及MODS具有重要的理論意義和實用價值。 LPS通過TLR4及其介導的信號通路激活細胞,誘導多種細胞因子的表達。在這些表達產(chǎn)物中,不僅有促炎細胞因子和抗炎細胞因子,還有趨化因子、抗微生物的蛋白、組織修復因子、代謝調(diào)控因子和獲得性免疫的調(diào)控因子。這些產(chǎn)物的功能不同,對組織損傷及內(nèi)環(huán)境的影響也有不同。例如,促炎細胞因子和抗微生物的蛋白對保護性免疫反應來說非常關鍵,但是,如前所述,持續(xù)或過度產(chǎn)生的促炎癥細胞因子可導致全身炎癥反應及休克,而過度產(chǎn)生的抵抗微生物的蛋白對內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性影響非常小。所以,為了免受致病菌的感染,在炎癥反應過程中需要對基因的表達進行精細的調(diào)控,既要控制促炎細胞因子的過度產(chǎn)生,以避免對組織的損傷；又要持續(xù)不斷地產(chǎn)生抗微生物的蛋白,防止微生物的入侵。 然而,這些具有不同功能的基因都受到同一個受體(TLR4)及其介導信號通路的調(diào)控,并且還發(fā)生在同一種細胞類型(如巨噬細胞)中,因此其調(diào)節(jié)必然要求下游水平的差異調(diào)控,以達到選擇性表達或沉默功能相同基因的目的。這一調(diào)節(jié)不影響受到相同受體誘導的其它基因的激活或抑制,是一種基因特異性的調(diào)控。 基因的特異性調(diào)控主要是在組蛋白修飾水平實現(xiàn)的。組蛋白修飾包括多種修飾方式,如賴氨酸甲基化、乙酰化,絲氨酸磷酸化,泛素化,糖基化等。這些修飾參與調(diào)控許多細胞生物學過程,包括基因表達、有絲分裂、細胞分化、X染色體失活以及基因印記等。調(diào)控組蛋白修飾的有組蛋白甲基轉移酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白乙酰轉移酶、組蛋白去乙�；敢约斑@些酶相關的蛋白復合體等。在這些酶及相關蛋白復合體的作用下,組蛋白的修飾發(fā)生改變,并可影響高度有序的染色質(zhì)結構和參與轉錄調(diào)控,這一調(diào)節(jié)主要體現(xiàn)在：①通過乙�；�/去乙�；淖兘M蛋白N端的電荷從而改變組蛋白和DNA的緊密程度；②形成一處有高親和力的位點,這一位點可以募集到具有局部重構染色質(zhì)作用的非組蛋白效應蛋白及復合體。 對內(nèi)毒素耐受(endotoxin tolerance)機制的深入研究證實了基因特異性調(diào)控這一觀點。內(nèi)毒素耐受是指動物或體外培養(yǎng)的巨噬細胞／單核細胞在給予LPS預處理后,再次給予LPS刺激時對LPS的反應降低,在動物模型中表現(xiàn)為動物死亡率降低,細胞因子如TNFα、IL-6和IL-1的釋放減少,但是與抗菌能力相關的分子如內(nèi)生性致熱原增加等；而離體巨噬/單核細胞則表現(xiàn)為LPS引起的補體受體3(complement receptor type3)和FcⅢ/Ⅱ受體表達上調(diào),Cnlp(cathelicidin-related antimicrobial peptide)表達亦增加。由于這兩類基因的誘導表達均依賴TLR及其介導的信號通路,因此推測它們的表達是受基因特異(gene-specific)而不是信號通路特異(signal-specific)機制的調(diào)控。 為了弄清調(diào)控這兩類功能不同基因的特異性機制,Foster等人按照功能和調(diào)節(jié)需要,將TLR誘導的基因分為兩類。第一類基因,耐受性(tolerizable)基因,在耐受的巨噬細胞受到LPS刺激時不能被再次誘導：第二類基因,非耐受性(non-tolerizable)基因,在耐受的巨噬細胞中仍然可以被誘導。研究發(fā)現(xiàn),耐受性基因包括了多種炎癥介質(zhì),而非耐受性基因包含了抗微生物因子、病原體識別受體、趨化因子和非直接引起組織損傷的其它基因。進一步研究發(fā)現(xiàn),這兩類基因的誘導表達需要不同的組蛋白修飾模式。正常巨噬細胞受到LPS刺激時,上述兩類基因啟動子區(qū)的組蛋白4(H4)均發(fā)生了乙酰化,但是只有非耐受性的基因在受到LPS的再次刺激后其啟動子部位的H4再次發(fā)生了乙�；�。在內(nèi)毒素耐受的巨噬細胞,非耐受性基因啟動子部位組蛋白乙�；降膭討B(tài)變化反映了基因表達水平的變化：即耐受的細胞在受到再次刺激前,與正常細胞相比其非耐受性基因啟動子處組蛋白乙�；乃奖３衷谙鄬^高的水平；受到刺激后乙�；竭M一步升高,甚至升得更快和更高。因此,可耐受性基因和不可耐受性基因其組蛋白的乙�；癄顟B(tài)直接與它們的轉錄活性相關。上述結果表明炎癥細胞是可以通過組蛋白修飾調(diào)控特定基因的表達狀態(tài),如激活還是沉默。 對基因特異性調(diào)控的認識,使我們開始反思現(xiàn)有一些抗炎藥物治療效果不佳或者副作用過大的原因。由于過度或持續(xù)炎癥反應對組織造成的損害主要由炎癥介質(zhì)的過度釋放引起,而炎癥介質(zhì)的過度釋放與相關信號通路激活有關,因此人們一直把注意力放在如何有效調(diào)控信號通路上,即試圖通過抑制信號通路控制炎癥介質(zhì)的過度產(chǎn)生,其結果是同時抑制了抗微生物多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生,使病人對感染的易感性增加,并且由于對其他保護反應如代謝和組織修復等的抑制而產(chǎn)生了很大的副作用。所以,探討組蛋白修飾在基因特異性調(diào)控中的作用,不僅有助于闡明內(nèi)毒素休克及炎癥相關性疾病的發(fā)病機制,而且為今后尋求更為有效、合理的抗炎藥物具有積極的指導作用。 基于上述認識,本實驗室前期利用蛋白質(zhì)組學技術分析了小鼠內(nèi)毒素休克后肝臟組織的核蛋白的變化,結果發(fā)現(xiàn)多個組蛋白成員的等電點發(fā)生了顯著酸化,這些變化多數(shù)發(fā)生在LPS刺激后的30min和3h時間點。組蛋白等電點的酸化主要與組蛋白的翻譯后修飾有關,這些修飾主要包括甲基化、乙�；�、磷酸化、泛素化等,經(jīng)過修飾的組蛋白可改變?nèi)旧|(zhì)的結構,進而對其下游基因的轉錄和表達發(fā)揮至關重要的作用。 因此,本實驗的主要目的是研究在內(nèi)毒素血癥中有哪些組蛋白修飾受到影響,探索調(diào)控炎癥因子轉錄的組蛋白修飾。據(jù)此,本實驗分為兩個部分： 第一部分：檢測LPS刺激巨噬細胞后組蛋白H3的K4、K9、K27、K36、 K79,組蛋白H4的K20位點處甲基化以及H3、H4泛乙�；淖兓闆r。 第二部分：探討在第一部分實驗中變化較明顯的修飾是否參與了炎癥因子IL-6和TNFα的轉錄調(diào)控。 實驗結果如下： 1.Western Blot實驗結果發(fā)現(xiàn),用LPS (100μg/L)刺激巨噬細胞(RAW264.7細胞和BMM細胞)0.5h、1h、2h、3h、6h后,與未刺激對照組(0h)相比,H3K4me2/3、H3K9me2/3、H3K27me2、H3K36me2、H3K79me2、 H4K20me3、H3乙�；4乙�；加胁煌潭鹊脑鰪�,其中,H3K4me2/3和H3K9me2/3增強明顯；H3K4me1、H3K9泛甲基化、H4K20me1/2無明顯變化。 2.由于H3K4me2和H3K9me2在LPS刺激巨噬細胞后0.5h明顯增強,故選擇這兩種修飾位點進行下一步實驗。分別用H3K4me2和H3K9me2的抗體富集與H3K4me2和H3K9me2位點結合的DNA(ChIP實驗),用熒光定量PCR實驗檢測與H3K4me2和H3K9me2位點結合的IL-6和TNFa基因啟動子的情況。結果顯示,LPS(100μg/L)刺激RAW264.7細胞0.5h后,H3K4me2與IL-6和TNFa基因啟動子結合增強,分別是對照組的121.8、5.46倍；H3K9me2與IL-6和TNFa基因啟動子的結合沒有增強。 3.為了進一步明確H3K4me2修飾是否參與了IL-6和TNFa的基因轉錄調(diào)控,本實驗用組蛋白甲基轉移酶抑制劑MTA (5'-Deoxy-tp-(methylthio)adenosine)抑制H3K4me2/3的修飾然后檢測其對IL-6和TNFa mRNA水平有無影響。結果發(fā)現(xiàn),用MTA(0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L)預處理RAW264.7細胞后,細胞免疫熒光實驗和Western Blot均顯示H3K4me2/3修飾受到抑制；進一步用熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),當H3K4me2/3被抑制后IL-6和TNFa的mRNA水平降低,其中,當MTA預處理濃度為0.5mmol/L時,與單獨LPS刺激后相比,IL-6的mRNA水平降低了47%, TNFα的mRNA水平降低了48%；當MTA預處理濃度為1mmol/L時,IL-6的mRNA水平降低了90%,TNFα的mRNA水平降低了78%。IL-6和TNFα mRNA水平的改變具有MTA濃度依賴性。 根據(jù)以上結果,得到以下初步結論： 1.在內(nèi)毒素血癥的發(fā)生發(fā)展過程中,H3K4me2/3、H3K9me2/3、 H3K27me2、H3K36me2、H3K79me2、H4乙�；l(fā)生了改變,且隨著時間的變化而動態(tài)變化。H3K4me2和H3K9me2/3在LPS刺激巨噬細胞后增強最明顯。 2.LPS刺激0.5h后H3K4me2與IL-6和TNFa基因啟動子結合增強；進一步用組蛋白甲基轉移酶抑制劑MTA抑制H3K4二甲基化和三甲基化后抑制IL-6和TNFa的基因轉錄,提示H3K4me2參與了炎癥介質(zhì)的轉錄調(diào)控。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3411

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