發(fā)布時(shí)間：2017-12-20 12:11

  本文關(guān)鍵詞：人C型凝集素受體Dectin-1新亞型的功能研究　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：白念珠菌（Candida albicans）是一種常見的條件致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，白念珠菌會(huì)侵入機(jī)體引發(fā)多種疾病，從輕度的皮膚黏膜感染到重癥的系統(tǒng)性真菌感染。盡管現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)不斷發(fā)展，但是有白念珠菌引發(fā)的感染率和死亡率依然很高。這就需要我們對(duì)于白念珠菌的致病性和機(jī)體對(duì)其的免疫反應(yīng)要有更深入的理解。白念珠菌是雙形態(tài)菌通常以酵母態(tài)粘附在人體的組織粘膜上,當(dāng)白念珠菌感染時(shí)，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別真菌細(xì)胞壁上的模式識(shí)別分子，觸發(fā)一系列的胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致許多轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。 固有免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體既可以識(shí)別白念珠菌表面的甘露聚糖和甘露糖蛋白，也可以識(shí)別白念珠菌出芽分裂是暴露的內(nèi)層的β-葡聚糖和幾丁質(zhì)。目前為止，識(shí)別這些不同病原相關(guān)模式分子的模式識(shí)別受體主要可以分為以下幾類：Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs），C型凝集素受體（C-type lectinreceptors，CLRs), NOD (nucleotide-binding domain leucine-rich repeat-containingreceptors，NLRs)樣受體和RIG（retinoic acid-inducible gene-I receptors,RLRs)樣受體。其中C型凝集素受體在抗真菌免疫中發(fā)揮著重要的作用。C型凝集素受體是由一類含有C型凝集素結(jié)構(gòu)域的蛋白組成的超家族。它可以識(shí)別大多數(shù)的致病真菌，其主要配體分子為真菌細(xì)胞壁表面的甘露糖和β-葡聚糖。 Dectin-1是研究最為全面的C型凝集素受體，它主要識(shí)別真菌細(xì)胞壁上的β-葡聚糖。Dectin-1可以介導(dǎo)吞噬細(xì)胞對(duì)白念珠菌的吞噬，并通過(guò)介導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生活性氧來(lái)直接殺傷真菌。Dectin-1是II跨膜蛋白，由胞外段的糖結(jié)合區(qū)域CRD結(jié)構(gòu)，跨膜段和胞內(nèi)的免疫受體絡(luò)氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosineactivation motif, ITAM）組成。Dectin-1被激活后，可以通過(guò)胞內(nèi)的ITAM基序來(lái)募集激活Syk激酶，誘導(dǎo)CARD9/Bcl10/MALT1形成復(fù)合體，進(jìn)而激活NF-κB,另外也可激活MAPKs和NFAT。 人的Dectin-1基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄后的可變剪貼產(chǎn)生了8個(gè)亞型，兩個(gè)主要亞型（A,B）和6個(gè)次要亞型（C，D，E，F(xiàn)，G，H）。在這8個(gè)亞型中只有三個(gè)亞型（A，B，，E,）同時(shí)具有完整的CRD結(jié)構(gòu)域和ITAM基序。前期的研究表明Dectin-1的A，B兩個(gè)亞型是主要的功能亞型，本課題對(duì)Dectin-1的E亞型進(jìn)行研究，探討其功能活性。 在第一部分的研究中我們利用RT-PCR技術(shù)從人的外周血中克隆得到了Dectin-1E亞型的基因序列。將Dectin-1E亞型克隆到慢病毒載體pRV3中，連同組成性質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞中包裝病毒，用包裝好的病毒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，獲得表達(dá)Dectin-1E亞型的RAW264.7-Dectin-1E細(xì)胞。我們用白念珠菌酵母態(tài)刺激RAW264.7-Dectin-1E細(xì)胞發(fā)現(xiàn)可以引起胞內(nèi)NF-κB通路關(guān)鍵分子IκB的磷酸化，最終激活NF-κB導(dǎo)致NF-κB p65亞單位入核增加。說(shuō)明Dectin-1E亞型可以介導(dǎo)白念珠菌刺激引起的胞內(nèi)信號(hào)通路的激活，我們首次明確了Dectin-1E亞型為功能亞型，可以識(shí)別被吞進(jìn)胞內(nèi)的白念珠菌。 在第二部分我們用原核表達(dá)獲得的人Dectin-1胞外段作為抗原免疫小鼠來(lái)制備Dectin-1的抗體。利用PCR技術(shù)克隆獲得Dectin-1胞外段序列，并構(gòu)pET-28a-Dectin-1胞外段和His的融合質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化受體菌E．coli BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，采用His親和純化方法，純化融合蛋白。將融合蛋白免疫小鼠，制備Dectin-1單克隆抗體，經(jīng)過(guò)篩選我們獲得4株雜交瘤細(xì)胞可以分泌抗體與Dectin-1E亞型結(jié)合。 簡(jiǎn)而言之，我們的研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的Dectin-1亞型可以介導(dǎo)白念珠菌酵母態(tài)刺激引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)，并制備了Dectin-1的小鼠單克隆抗體。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R379.4

【共引文獻(xiàn)】

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：1312038