發(fā)布時(shí)間：2017-12-19 22:26

  本文關(guān)鍵詞：利用多種細(xì)胞篩選抗氧化物質(zhì)方法的研究　出處：《廣東藥學(xué)院》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 多種細(xì)胞 抗氧化 篩檢

【摘要】：研究背景： 隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境污染日益嚴(yán)重，日常生活中接觸的氧化應(yīng)激源的種類和頻率較之前有大幅增加。氧化應(yīng)激機(jī)制及防護(hù)成為近年來(lái)保健品和個(gè)人護(hù)理用品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。外源性的多種氧化應(yīng)激源會(huì)攻擊生物分子、蛋白、脂質(zhì)或核酸，造成細(xì)胞的氧化損傷，直接或間接地導(dǎo)致多種病理反應(yīng)的出現(xiàn)。紫外線照射和化學(xué)污染物造成的氧化應(yīng)激與皮膚的老化、色素沉著、炎癥及多種疾病的關(guān)系已得到充分的證明。許多化妝品公司推出了多種宣稱可以清除氧化自由基、延緩皮膚衰老的產(chǎn)品，但對(duì)其是否能達(dá)到宣稱的效果至今尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)價(jià)方法。另一方面，從植物提取物、化學(xué)合成、生物轉(zhuǎn)錄等途徑獲得的活性原料也需要建立一套科學(xué)高效的篩查方法。本研究旨在建立標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞氧化損傷快速檢測(cè)方法，用于化學(xué)物或化妝品的抗氧化功效性評(píng)價(jià)。 目前，對(duì)于氧化反應(yīng)機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚未完全明確，但可以認(rèn)為氧化損傷涉及多通路和多基因聯(lián)合作用的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程。其中氧化損傷過(guò)程中的一些重要的靶細(xì)胞、限制酶、中間體和產(chǎn)物是關(guān)鍵的篩查指針和標(biāo)志物。因而可根據(jù)氧化反應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制建立抗氧化合物檢測(cè)和篩查的方法�？寡趸镔|(zhì)研究方法可歸納為動(dòng)物模型法、人體評(píng)價(jià)法、化學(xué)檢測(cè)法和細(xì)胞法四種，各有其特點(diǎn)和不足。特別是在提倡動(dòng)物福利、避免不必要的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的背景下，建立科學(xué)、高效和快速的方法是優(yōu)先選擇。本研究以多種細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，模擬夏日日光輻射類型誘發(fā)細(xì)胞的氧化損傷模型，建立快速篩查方法。以正常皮膚HaCaT角質(zhì)細(xì)胞系、原代人皮膚成纖維細(xì)胞為對(duì)象，通過(guò)對(duì)紫外線照射細(xì)胞后引起氧化損傷的多種生物標(biāo)志的檢測(cè)判斷物質(zhì)的抗氧化性；以H2O2誘導(dǎo)Coca-2細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，判斷物質(zhì)的對(duì)于不同細(xì)胞類型是否具有相同的抗氧化性；同時(shí)，使用Episkin皮膚模型，對(duì)該模型能否應(yīng)用于抗氧化物質(zhì)的篩選進(jìn)行了初步探索。 研究目的 以體外培養(yǎng)的HaCaT角質(zhì)細(xì)胞、原代人皮膚成纖維細(xì)胞、Coca-2細(xì)胞和Episkin皮膚模型為對(duì)象，分別造成紫外線及H_2O_2誘發(fā)的細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，通過(guò)監(jiān)測(cè)添加待測(cè)物質(zhì)后細(xì)胞凋亡情況、細(xì)胞周期阻滯情況、活性氧族（ROS）水平和超氧化物岐酶（SOD）水平的檢測(cè)，建立利用多種細(xì)胞篩選抗氧化物質(zhì)的方法，提供抗氧化特性的預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)。 研究?jī)?nèi)容與方法 1、細(xì)胞培養(yǎng)：HaCaT細(xì)胞：使用MEM培養(yǎng)基，加入10%的新生牛血清；原代人皮膚成纖維細(xì)胞：使用DMEM培養(yǎng)基，加入10%的胎牛血清；Coca-2細(xì)胞：使用DMEM培養(yǎng)基，加入12%的胎牛血清；Episkin皮膚模型：使用MEM培養(yǎng)基。為皮膚模型自帶培養(yǎng)基。細(xì)胞定量接種于75cm~2培養(yǎng)瓶或直徑為65mm培養(yǎng)皿中；皮膚模型使用12孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。培養(yǎng)條件均為37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2、篩查物質(zhì)：POCI：植物提純物，主要成分為原花青素；LBPC：植物提純物，主要成分為枸杞多糖；FFNT：化學(xué)衍生物；C36D：化學(xué)衍生物。 3、氧化損傷模型及篩查物質(zhì)細(xì)胞毒性暴露劑量確定：使用MTT法分別測(cè)定不同紫外線輻照劑量對(duì)HaCaT細(xì)胞、原代人皮膚成纖維細(xì)胞和皮膚模型的細(xì)胞存活率的影響；測(cè)量不同濃度的H_2O_2對(duì)Coca-2細(xì)胞存活率的影響，確定試驗(yàn)輻照劑量及H_2O_2濃度。測(cè)定各待測(cè)物質(zhì)的細(xì)胞毒性劑量，為試驗(yàn)提供濃度劑量選擇依據(jù)。 4、抗氧化特性篩查：分別用紫外線或化學(xué)物誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，分別加入篩查物質(zhì)，通過(guò)監(jiān)測(cè)不同的指標(biāo)預(yù)測(cè)篩查物質(zhì)的抗氧化特性。試驗(yàn)設(shè)立空白對(duì)照組，模型組，抗壞血酸組陽(yáng)性對(duì)照組和待測(cè)物質(zhì)組，其中HaCaT細(xì)胞和原代人皮膚成纖維細(xì)胞檢測(cè)了4種物質(zhì)，Coca-2細(xì)胞檢測(cè)了2種物質(zhì)。 4.1氧化應(yīng)激細(xì)胞損傷的檢測(cè)指標(biāo)：用熒光探針（DCFH-DA）標(biāo)記ROS的方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS的生成情況，使用酶生化法測(cè)定SOD的水平，使用PI熒光染料標(biāo)記法測(cè)定細(xì)胞周期，使用Annexinv/PI雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡。選用抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，用以評(píng)價(jià)待這四項(xiàng)指標(biāo)是否穩(wěn)定且敏感。 4.2、氧化損傷作用篩查：紫外線及H_2O_2造模后，分別檢測(cè)加入待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行干預(yù)后上述的四項(xiàng)指標(biāo)，對(duì)各指標(biāo)變化進(jìn)行評(píng)價(jià)，考察待測(cè)物質(zhì)是否能夠?qū)ρ趸瘧?yīng)激產(chǎn)生拮抗作用，并評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力的強(qiáng)弱。為對(duì)待測(cè)物質(zhì)抗氧化特性及強(qiáng)度的預(yù)測(cè)提供依據(jù)。 5、統(tǒng)計(jì)方法：各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。多組之間差異的比較用單因素的方差分析，組間兩兩比較用SNK檢驗(yàn)法，顯著性水平α=0.05，P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用ModfitLT軟件對(duì)細(xì)胞周期結(jié)果進(jìn)行分析。 研究結(jié)果 1.氧化損傷模型的建立： 本研究建立的多種細(xì)胞氧化損傷模型，對(duì)于皮膚細(xì)胞或組織采用紫外線照射法，對(duì)腸上皮細(xì)胞采用化合物暴露法。當(dāng)UVA劑量為5J/cm~2，UVB劑量為0.6J/cm~2時(shí)，能夠抑制20%的HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)；當(dāng)UVA劑量為8J/cm~2，UVB劑量為1J/cm~2時(shí)，能夠抑制20%的原代人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)；當(dāng)H_2O_2濃度為150μmol/L時(shí)，能夠抑制20%的Coca-2細(xì)胞生長(zhǎng)，在上述劑量下，細(xì)胞產(chǎn)生一定氧化應(yīng)激損傷，但仍保持一定的增殖活力，適合進(jìn)行下一步試驗(yàn)。 當(dāng)UVA劑量分別為0J/cm~2，5J/cm~2，15J/cm~2，25J/cm~2，35J/cm~2，45J/cm~2時(shí)，UVB劑量約為0J/cm~2，1J/cm~2，3J/cm~2，5J/cm~2，7J/cm~2，9J/cm~2時(shí)，Episkin皮膚模型中細(xì)胞存活率存在劑量反應(yīng)關(guān)系。 2待測(cè)物質(zhì)細(xì)胞毒性劑量確定： 對(duì)物質(zhì)抗氧化性的研究應(yīng)建立在其對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用的濃度范圍內(nèi)。對(duì)于HaCaT細(xì)胞，抗壞血酸在100μmol/L，POCI在50mg/L，LBPC在400mg/L，F(xiàn)FNT8mg/L，C36D90mg/L濃度時(shí)可以抑制約10%細(xì)胞的增殖；對(duì)于原代人成纖維細(xì)胞，抗壞血酸在100μmol/L，POCI在50mg/L，LBPC在300mg/L，F(xiàn)FNT在6mg/L，C36D在90mg/L濃度時(shí)可以抑制約10%細(xì)胞的增殖；對(duì)于Coca-2，抗壞血酸在100μmol/L， POCI在50mg/L，LBPC在300mg/L濃度時(shí)可以抑制約10%細(xì)胞的增殖。 3抗氧化損傷作用評(píng)價(jià) 3.1.ROS熒光強(qiáng)度水平 抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，其能夠明顯降低添加物質(zhì)組的ROS熒光強(qiáng)度水平。對(duì)于HaCaT細(xì)胞，抗壞血酸組，POCI組及LBPC組細(xì)胞ROS水平較空白對(duì)照組高，，但較模型組低，F(xiàn)FNT組及C36D組細(xì)胞ROS水平與模型組無(wú)差異，且較空白對(duì)照組高；原代人成纖維細(xì)胞經(jīng)過(guò)紫外線輻照后，其ROS水平高于其余兩組細(xì)胞，并且其本底的ROS水平較高，抗壞血酸，POCI及LBPC均能較模型組降低ROS水平，F(xiàn)FNT組及C36D組細(xì)胞內(nèi)ROS水平與HaCaT細(xì)胞類似；在Caco-2細(xì)胞中，抗壞血酸，POCI及LBPC均能較模型組降低ROS水平。LBPC組的ROS水平普遍高于POCI及抗壞血酸組。 3.2.SOD結(jié)果 添加抗壞血酸，POCI及LBPC物質(zhì)能夠幫助HaCaT細(xì)胞及原代人成纖維細(xì)胞升高胞內(nèi)SOD水平，從而達(dá)到清除ROS，拮抗氧化損傷的目的，而FFNT及C36D不能升高上述兩種細(xì)胞內(nèi)SOD水平。Caco-2細(xì)胞的本底SOD值較高，但其添加物質(zhì)組的SOD水平變化趨勢(shì)與其余細(xì)胞一致。 3.3細(xì)胞凋亡結(jié)果 三種細(xì)胞均顯示了氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。兩種細(xì)胞系的模型組，早期凋亡的細(xì)胞所占比例較大，而原代細(xì)胞中，中、晚期凋亡的比例大于早期凋亡的細(xì)胞；在其余組別中，存活細(xì)胞占絕對(duì)多數(shù)，凋亡各期細(xì)胞比例較小。三種細(xì)胞中所添加的抗壞血酸，POCI及LBPC均能抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；FFNT組及C36D組導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞及原代人成纖維細(xì)胞中、晚期凋亡細(xì)胞所占比例較高，較模型組比例更高。FFNT及C36D由于有抑制成纖維細(xì)胞的作用，故而原代人成纖維細(xì)胞的中晚期凋亡細(xì)胞所占比例為絕對(duì)多數(shù)，與HaCaT細(xì)胞存在一定差異。 3.4.細(xì)胞周期結(jié)果 模型組中，三種細(xì)胞均發(fā)生了G0/G1期阻滯，其中以兩種皮膚細(xì)胞的阻滯最為明顯。Caco-2細(xì)胞的模型組，與同種細(xì)胞其余各組G0/G1期細(xì)胞相比，差異不大，但G2期明顯降低。在添加抗壞血酸，POCI及LBPC組，三種細(xì)胞的各周期指標(biāo)與空白對(duì)照組接近；而FFNT及C36D對(duì)紫外誘導(dǎo)后HaCaT細(xì)胞及原代人成纖維細(xì)胞的各周期指標(biāo)影響不大，與模型組差異不大。 研究結(jié)論 1.本研究根據(jù)不同應(yīng)激源的損傷機(jī)制，分別建立了紫外線損傷角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和三維皮膚替代物的氧化應(yīng)激模型，建立了過(guò)氧化氫損傷腸上皮的氧化應(yīng)激模型。結(jié)果表明在IC20的紫外線劑量下和化合物暴露劑量下可誘導(dǎo)多種細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型，用于抗氧化劑的篩選。 2.本研究根據(jù)篩查物的預(yù)期用途檢測(cè)了4種不同化合物，結(jié)果提示：在紫外線誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模式下，可以使用HaCaT細(xì)胞和原代人皮膚成纖維細(xì)胞對(duì)物質(zhì)進(jìn)行抗氧化劑篩檢，使用4種指標(biāo)能夠綜合判斷物質(zhì)的抗氧化特性，而僅使用ROS水平及周期指標(biāo)也可以初步判斷物質(zhì)是否具有抗氧化屬性。在H_2O_2應(yīng)激模式下，由于氧化應(yīng)激通路的差異，提示采用ROS、SOD水平及凋亡指標(biāo)可初步判斷物質(zhì)是否具有抗氧化特性。 3.本研究根據(jù)篩查物的理化特性建立了不同的篩查系統(tǒng)，用于不同實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的評(píng)價(jià)。細(xì)胞模型適宜用于原料、化合物和可溶性配方的篩檢，皮膚模型適宜用于原料、配方及成品的檢測(cè)。 4.本研究結(jié)果提示低劑量紫外線輻射可以促進(jìn)HaCaT細(xì)胞和原代人皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，推測(cè)可能與細(xì)胞的代償性增生有關(guān)，確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王紅偉,尚蘭琴,郝衛(wèi)東;長(zhǎng)波紫外線致人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡和活性氧生成的作用[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年01期

2 崔志文;黃琴;黃怡;吳紅照;文靜;李衛(wèi)芬;;枯草芽孢桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞抗氧化功能的影響研究[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2011年02期

3 宋琦如;王發(fā)選;楊瑾;;枸杞多糖對(duì)長(zhǎng)波紫外線輻射暴露的人皮膚成纖維細(xì)胞的影響[J];環(huán)境與健康雜志;2007年08期

4 李立;白雪濤;張宏偉;魏嵐;;長(zhǎng)波紫外線照射對(duì)HaCaT細(xì)胞氧化損傷作用的研究[J];環(huán)境與健康雜志;2010年03期

5 周瓊;雷鐵池;耿晶;陳向東;車巍;饒立;徐世正;;細(xì)菌衍生黑素對(duì)長(zhǎng)波紫外線誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡和壞死的保護(hù)[J];臨床皮膚科雜志;2008年01期

6 王業(yè)秋;陳巧云;張寧;井麗巍;祁永華;;玉竹對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J];中國(guó)美容醫(yī)學(xué);2012年04期

7 韓飛;周孟良;錢健亞;于婷婷;;抗氧化劑抗氧化活性測(cè)定方法及其評(píng)價(jià)[J];糧油食品科技;2009年06期

8 王孟麗;沈曉麗;林真;林麗芳;;人皮膚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)的研究[J];心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志;2009年05期

9 徐道華;周晨慧;吳鐵;許碧連;;丹皮酚對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的抑制作用(英文)[J];中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2008年06期

10 王宜慶;唐萌;張婷;陸敏玉;楊揚(yáng);張姍姍;孔璐;劉曉閏;薛玉英;張宇;;不同量子點(diǎn)誘導(dǎo)L 929細(xì)胞氧化損傷及凋亡作用[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2011年08期

本文編號(hào)：1309681