本文關鍵詞：自動捕獲內(nèi)皮祖細胞促進血管化的新型皮膚替代物的實驗研究

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【摘要】：研究背景 隨著皮膚組織工程研究的進展，從表皮、成纖維細胞的培養(yǎng)與移植到真皮支架的研制與應用技術已較為成熟，各種人工皮膚產(chǎn)品也相繼問世，尤其是各種真皮替代物成功應用于臨床并收到了良好的修復效果。在此基礎上，有研究者利用表皮細胞、成纖維細胞復合真皮支架構，成功構建了可以一次性修復缺損皮膚的活性皮膚替代物，然而，其不僅構建時間長，程序復雜，而且移植后血管化慢、存活率低，限制了其臨床應用，因此尋找一種快速構建皮膚替代物并促進其血管化的方法成為皮膚組織工程研究中亟待解決的難題。 目前組織工程皮膚的制備主要基于傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)模式，常規(guī)方法需要首先擴增足量的細胞后，再接種于真皮支架上進行2-3周的培養(yǎng)才能完成構建，其不僅耗時長，不能及時滿足臨床需要，而且長時間的培養(yǎng)容易導致細胞老化、增殖活性降低。三維培養(yǎng)方式及微載體培養(yǎng)技術的出現(xiàn)為解決貼壁依賴型細胞的大規(guī)�？焖倥囵B(yǎng)提供了有效方法，現(xiàn)已廣泛地應用于生物制藥領域。前期研究中我們將人胎盤來源的羊膜制備為羊膜微粒，發(fā)現(xiàn)其不僅具備良好的組織相容性適宜作為真皮支架，而且以其作為微載體能夠快速擴增表皮干細胞。因此，本研究擬在上述研究的基礎上以羊膜微粒作為真皮支架，采用三維培養(yǎng)技術提供一種快速構建活性真皮替代物的方法。 組織工程皮膚如何快速血管化一直是皮膚組織工程研究的熱點及難點。目前研究者主要采用真皮支架連接血管生成相關因子或進行體外構建微血管樣結構的方式，這些方法均存在一定的局限性，因為新生血管形成需多種因子、細胞外基質(zhì)及相關細胞的共同參與，單一的調(diào)控因素效果并不理想。此外體外構建內(nèi)皮化的皮膚替代物雖具有一定應用前景，但操作難度大，技術條件要求高，難以廣泛推廣。最近研究表明，存在于外周循環(huán)血液中的內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitor cells，EPC)是新生血管形成的關鍵參與者，其不僅直接參與缺血組織的干細胞血管發(fā)生,而且通過分化為內(nèi)皮細胞參與局部新生血管形成過程。然而，由于分離、培養(yǎng)自體EPC的方法尚未成熟，使EPC的應用受到極大的限制。最新研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞衍生因子-1α（Stromalcell-derived factor-1alpha，SDF-1α）是EPC的強大趨化劑，它通過與EPC表面的特異性受體CXCR4(chemokine CXC receptor type4,CXCR4)結合，在短時間內(nèi)即可迅速動員骨髓中EPC進入外周血，并介導外周血中的EPC遷移、歸巢到缺血缺氧組織局部，參與血管新生及損傷血管的再內(nèi)皮化。 本研究設想，利用SDF-1α對EPC的強大趨化作用，以羊膜微粒作為真皮支架，結合三維旋轉培養(yǎng)系統(tǒng)，設計一種能自動捕獲外周血中EPC并快速構建活性真皮替代物的方法。 研究方法 1. SDF-1α質(zhì)粒構建與慢病毒包裝 1.1重組質(zhì)粒構建 利用cDNA文庫，以PCR方法獲取目的基因，將目的基因SDF-1α與pGC-FU載體融合獲得重組質(zhì)粒。再將目的質(zhì)粒轉染至293T細胞， Western Blot檢測轉染293T的樣品。 1.2SDF-1α-LV慢病毒包裝 將帶有GFP熒光且過表達SDF-1α的重組質(zhì)粒和輔助原件質(zhì)粒共轉染至293T細胞獲得慢病毒濃縮液，利用Real Time-PCR法對不同濃度病毒感染后樣品組的CT值及表達量進行分析，檢測病毒滴度。 2. SDF-1α慢病毒轉染成纖維細胞 2.1轉染效率評價 預實驗確定適合的MOI值，SDF-1α-LV轉染人皮膚成纖維細胞獲得SDF-1α過表達成纖維細胞（SDFovHDF）,熒光顯微鏡下觀察細胞轉染后綠色熒光表達情況，流式細胞術檢測病毒轉染效率。 2.2目的基因及蛋白表達測定 Realtime-PCR檢測目的基因表達情況，ELISA檢測轉基因細胞培養(yǎng)上清中目的蛋白含量。 3. EPC趨化、遷移實驗 采用Transwell共培養(yǎng)小室遷移實驗及劃痕實驗，評價SDFovHDF對EPC的趨化、遷移作用的影響。 4．構建活性真皮替代物 以羊膜微粒作為真皮支架，SDFovHDF為種子細胞，利用三維旋轉培養(yǎng)體系構建含成纖維細胞的活性真皮替代物。熒光顯微鏡、掃描電鏡觀察成纖維細胞粘附增殖情況。 5.活性真皮替代物移植全層皮膚缺損創(chuàng)面 以C57BL鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面為動物移植模型，將構建好的含成纖維細胞的真皮替代物移植創(chuàng)面，定期檢測外周血EPC數(shù)量，測定創(chuàng)面愈合率，并行組織學檢測、血管化評價。 研究結果 1．慢病毒轉染成纖維細胞鑒定 SDF-1α過表達質(zhì)粒測序結果正確，慢病毒滴度均在2.00E+8TU/ml，MOI值為20時可獲得理想的感染效率。 流式細胞術檢測成纖維細胞感染率均在90%以上。病毒感染后5天鏡下觀察，可見SDFovHDF組陽性信號集中于胞漿中，GFP-HDF組細胞整體均發(fā)綠色熒光。RealTime-PCR結果顯示，，SDFovHDF組mRNA表達量相對未感染組為5.3倍。ELISA檢測轉染細胞培養(yǎng)上清SDF-1α表達量為173±6pg/10^6個細胞，GFP-HDF組未檢測到。 2. SDFov HDF細胞對EPC的遷移、趨化效果 Transwell共培養(yǎng)小室遷移實驗表明，三組細胞(SDFovHDF組、GFP-HDF組及HDF組)趨化的內(nèi)皮祖細胞數(shù)量分別為為392±27個/視野,204±17個/視野(p＜0.01),181±17個/視野(p＜0.01),表明SDFovHDF對EPC具有明顯的趨化作用。 劃痕實驗表明SDFovHDF組培養(yǎng)上清可顯著增強EPC的遷移能力，在24h內(nèi)細胞遷移數(shù)量為72±8.3個，明顯高于HDF組41±5.7個(p＜0.01)及DMEM組38±6.7個(p＜0.01)。 3.構建活性真皮替代物 培養(yǎng)24h觀察即可見微型真皮替代物表面成纖維細胞形態(tài)良好，呈三維立體生長，此后細胞逐漸增殖，培養(yǎng)5-7d即可見細胞布滿微粒表面，部分微粒間相互粘連成團。 掃描電鏡可見細胞密集粘附于羊膜微粒表面，細胞形態(tài)飽滿呈梭形，部分微粒呈球形卷曲。 4.活性真皮替代物移植促進創(chuàng)面修復 移植后3、5、7天測定小鼠外周血EPC顯示，SDFovHDF組EPC百分比明顯高于其他組(p＜0.01)。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)SDFovHDF組血管化明顯，血管密度明顯高于其他組(p＜0.01)。Western Blot檢測3d、5d、7d、10d創(chuàng)面SDF-1α含量發(fā)現(xiàn)SDFovHDF-mAM組顯著高于其他實驗組。 計算創(chuàng)面愈合速度表明SDFovHDF組愈合時間為17.25±0.7天，明顯快于HDF微粒組18.5±1.2天(p＜0.01)、空白微粒組18.87±1.1天(p＜0.01)。創(chuàng)面愈合后觀察可見微粒移植組創(chuàng)面愈合平整、柔軟，收縮程度輕。組織學檢測可見微粒填充作為真皮基質(zhì)，表皮復層較厚。 研究結論 1、利用過表達SDF-1α基因的方法，成功構建了一種自動捕獲內(nèi)皮祖細胞促進皮膚替代物血管化的新方法，摒棄了常規(guī)采用體外培養(yǎng)、擴增內(nèi)皮祖細胞，然后種植于真皮支架中進行移植的傳統(tǒng)模式，為促進組織工程皮膚血管化提供了新思路。 2、采用羊膜微粒作為真皮支架，結合旋轉培養(yǎng)系統(tǒng)可高效快速構建含成纖維細胞的活性皮膚替代物，改善了傳統(tǒng)二維培養(yǎng)構建皮膚替代物的方式。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 韓躍東;劉玲;;組織工程皮膚的臨床應用[J];國際皮膚性病學雜志;2007年06期

2 孫錦章;韓春茂;;組織工程皮膚構建的研究進展[J];國際外科學雜志;2006年05期

3 劉杰,王德文,彭瑞云;皮膚組織工程學研究中的新技術和新方法[J];現(xiàn)代康復;2001年16期

本文編號：1303488