本文關(guān)鍵詞：自動(dòng)捕獲內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)血管化的新型皮膚替代物的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：研究背景 隨著皮膚組織工程研究的進(jìn)展，從表皮、成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與移植到真皮支架的研制與應(yīng)用技術(shù)已較為成熟，各種人工皮膚產(chǎn)品也相繼問(wèn)世，尤其是各種真皮替代物成功應(yīng)用于臨床并收到了良好的修復(fù)效果。在此基礎(chǔ)上，有研究者利用表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞復(fù)合真皮支架構(gòu)，成功構(gòu)建了可以一次性修復(fù)缺損皮膚的活性皮膚替代物，然而，其不僅構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng)，程序復(fù)雜，而且移植后血管化慢、存活率低，限制了其臨床應(yīng)用，因此尋找一種快速構(gòu)建皮膚替代物并促進(jìn)其血管化的方法成為皮膚組織工程研究中亟待解決的難題。 目前組織工程皮膚的制備主要基于傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)模式，常規(guī)方法需要首先擴(kuò)增足量的細(xì)胞后，再接種于真皮支架上進(jìn)行2-3周的培養(yǎng)才能完成構(gòu)建，其不僅耗時(shí)長(zhǎng)，不能及時(shí)滿足臨床需要，而且長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)容易導(dǎo)致細(xì)胞老化、增殖活性降低。三維培養(yǎng)方式及微載體培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)為解決貼壁依賴型細(xì)胞的大規(guī)�？焖倥囵B(yǎng)提供了有效方法，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域。前期研究中我們將人胎盤(pán)來(lái)源的羊膜制備為羊膜微粒，發(fā)現(xiàn)其不僅具備良好的組織相容性適宜作為真皮支架，而且以其作為微載體能夠快速擴(kuò)增表皮干細(xì)胞。因此，本研究擬在上述研究的基礎(chǔ)上以羊膜微粒作為真皮支架，采用三維培養(yǎng)技術(shù)提供一種快速構(gòu)建活性真皮替代物的方法。 組織工程皮膚如何快速血管化一直是皮膚組織工程研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。目前研究者主要采用真皮支架連接血管生成相關(guān)因子或進(jìn)行體外構(gòu)建微血管樣結(jié)構(gòu)的方式，這些方法均存在一定的局限性，因?yàn)樾律苄纬尚瓒喾N因子、細(xì)胞外基質(zhì)及相關(guān)細(xì)胞的共同參與，單一的調(diào)控因素效果并不理想。此外體外構(gòu)建內(nèi)皮化的皮膚替代物雖具有一定應(yīng)用前景，但操作難度大，技術(shù)條件要求高，難以廣泛推廣。最近研究表明，存在于外周循環(huán)血液中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPC)是新生血管形成的關(guān)鍵參與者，其不僅直接參與缺血組織的干細(xì)胞血管發(fā)生,而且通過(guò)分化為內(nèi)皮細(xì)胞參與局部新生血管形成過(guò)程。然而，由于分離、培養(yǎng)自體EPC的方法尚未成熟，使EPC的應(yīng)用受到極大的限制。最新研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（Stromalcell-derived factor-1alpha，SDF-1α）是EPC的強(qiáng)大趨化劑，它通過(guò)與EPC表面的特異性受體CXCR4(chemokine CXC receptor type4,CXCR4)結(jié)合，在短時(shí)間內(nèi)即可迅速動(dòng)員骨髓中EPC進(jìn)入外周血，并介導(dǎo)外周血中的EPC遷移、歸巢到缺血缺氧組織局部，參與血管新生及損傷血管的再內(nèi)皮化。 本研究設(shè)想，利用SDF-1α對(duì)EPC的強(qiáng)大趨化作用，以羊膜微粒作為真皮支架，結(jié)合三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，設(shè)計(jì)一種能自動(dòng)捕獲外周血中EPC并快速構(gòu)建活性真皮替代物的方法。 研究方法 1. SDF-1α質(zhì)粒構(gòu)建與慢病毒包裝 1.1重組質(zhì)粒構(gòu)建 利用cDNA文庫(kù)，以PCR方法獲取目的基因，將目的基因SDF-1α與pGC-FU載體融合獲得重組質(zhì)粒。再將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞， Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染293T的樣品。 1.2SDF-1α-LV慢病毒包裝 將帶有GFP熒光且過(guò)表達(dá)SDF-1α的重組質(zhì)粒和輔助原件質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞獲得慢病毒濃縮液，利用Real Time-PCR法對(duì)不同濃度病毒感染后樣品組的CT值及表達(dá)量進(jìn)行分析，檢測(cè)病毒滴度。 2. SDF-1α慢病毒轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞 2.1轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià) 預(yù)實(shí)驗(yàn)確定適合的MOI值，SDF-1α-LV轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞獲得SDF-1α過(guò)表達(dá)成纖維細(xì)胞（SDFovHDF）,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后綠色熒光表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染效率。 2.2目的基因及蛋白表達(dá)測(cè)定 Realtime-PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)情況，ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋白含量。 3. EPC趨化、遷移實(shí)驗(yàn) 采用Transwell共培養(yǎng)小室遷移實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)SDFovHDF對(duì)EPC的趨化、遷移作用的影響。 4．構(gòu)建活性真皮替代物 以羊膜微粒作為真皮支架，SDFovHDF為種子細(xì)胞，利用三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)體系構(gòu)建含成纖維細(xì)胞的活性真皮替代物。熒光顯微鏡、掃描電鏡觀察成纖維細(xì)胞粘附增殖情況。 5.活性真皮替代物移植全層皮膚缺損創(chuàng)面 以C57BL鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面為動(dòng)物移植模型，將構(gòu)建好的含成纖維細(xì)胞的真皮替代物移植創(chuàng)面，定期檢測(cè)外周血EPC數(shù)量，測(cè)定創(chuàng)面愈合率，并行組織學(xué)檢測(cè)、血管化評(píng)價(jià)。 研究結(jié)果 1．慢病毒轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞鑒定 SDF-1α過(guò)表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果正確，慢病毒滴度均在2.00E+8TU/ml，MOI值為20時(shí)可獲得理想的感染效率。 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)成纖維細(xì)胞感染率均在90%以上。病毒感染后5天鏡下觀察，可見(jiàn)SDFovHDF組陽(yáng)性信號(hào)集中于胞漿中，GFP-HDF組細(xì)胞整體均發(fā)綠色熒光。RealTime-PCR結(jié)果顯示，，SDFovHDF組mRNA表達(dá)量相對(duì)未感染組為5.3倍。ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清SDF-1α表達(dá)量為173±6pg/10^6個(gè)細(xì)胞，GFP-HDF組未檢測(cè)到。 2. SDFov HDF細(xì)胞對(duì)EPC的遷移、趨化效果 Transwell共培養(yǎng)小室遷移實(shí)驗(yàn)表明，三組細(xì)胞(SDFovHDF組、GFP-HDF組及HDF組)趨化的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量分別為為392±27個(gè)/視野,204±17個(gè)/視野(p＜0.01),181±17個(gè)/視野(p＜0.01),表明SDFovHDF對(duì)EPC具有明顯的趨化作用。 劃痕實(shí)驗(yàn)表明SDFovHDF組培養(yǎng)上清可顯著增強(qiáng)EPC的遷移能力，在24h內(nèi)細(xì)胞遷移數(shù)量為72±8.3個(gè)，明顯高于HDF組41±5.7個(gè)(p＜0.01)及DMEM組38±6.7個(gè)(p＜0.01)。 3.構(gòu)建活性真皮替代物 培養(yǎng)24h觀察即可見(jiàn)微型真皮替代物表面成纖維細(xì)胞形態(tài)良好，呈三維立體生長(zhǎng)，此后細(xì)胞逐漸增殖，培養(yǎng)5-7d即可見(jiàn)細(xì)胞布滿微粒表面，部分微粒間相互粘連成團(tuán)。 掃描電鏡可見(jiàn)細(xì)胞密集粘附于羊膜微粒表面，細(xì)胞形態(tài)飽滿呈梭形，部分微粒呈球形卷曲。 4.活性真皮替代物移植促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù) 移植后3、5、7天測(cè)定小鼠外周血EPC顯示，SDFovHDF組EPC百分比明顯高于其他組(p＜0.01)。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SDFovHDF組血管化明顯，血管密度明顯高于其他組(p＜0.01)。Western Blot檢測(cè)3d、5d、7d、10d創(chuàng)面SDF-1α含量發(fā)現(xiàn)SDFovHDF-mAM組顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。 計(jì)算創(chuàng)面愈合速度表明SDFovHDF組愈合時(shí)間為17.25±0.7天，明顯快于HDF微粒組18.5±1.2天(p＜0.01)、空白微粒組18.87±1.1天(p＜0.01)。創(chuàng)面愈合后觀察可見(jiàn)微粒移植組創(chuàng)面愈合平整、柔軟，收縮程度輕。組織學(xué)檢測(cè)可見(jiàn)微粒填充作為真皮基質(zhì)，表皮復(fù)層較厚。 研究結(jié)論 1、利用過(guò)表達(dá)SDF-1α基因的方法，成功構(gòu)建了一種自動(dòng)捕獲內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)皮膚替代物血管化的新方法，摒棄了常規(guī)采用體外培養(yǎng)、擴(kuò)增內(nèi)皮祖細(xì)胞，然后種植于真皮支架中進(jìn)行移植的傳統(tǒng)模式，為促進(jìn)組織工程皮膚血管化提供了新思路。 2、采用羊膜微粒作為真皮支架，結(jié)合旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)可高效快速構(gòu)建含成纖維細(xì)胞的活性皮膚替代物，改善了傳統(tǒng)二維培養(yǎng)構(gòu)建皮膚替代物的方式。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 韓躍東;劉玲;;組織工程皮膚的臨床應(yīng)用[J];國(guó)際皮膚性病學(xué)雜志;2007年06期

2 孫錦章;韓春茂;;組織工程皮膚構(gòu)建的研究進(jìn)展[J];國(guó)際外科學(xué)雜志;2006年05期

3 劉杰,王德文,彭瑞云;皮膚組織工程學(xué)研究中的新技術(shù)和新方法[J];現(xiàn)代康復(fù);2001年16期

本文編號(hào)：1303488