本文關鍵詞：HCMV基因在小鼠胚胎成纖維細胞中的表達及病毒感染對細胞自噬的影響

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【摘要】：目的： 1.檢測人巨細胞病毒(human cytomegalo virus, HCMV)基因在人胚胎成纖維細胞(Human embryo fibroblast, HEF)和小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryo fibroblast,MEF)中的表達情況,為進一步研究HCMV種屬特異性的機制奠定分子生物學基礎。 2.觀察HCMV感染對HEF和MEF細胞自噬的影響,為HCMV種屬特異性的研究尋找新的方向和證據(jù)。 方法： 1.組織塊分離培養(yǎng)法結合膠原酶消化法分離原代HEF和MEF細胞。 2.在HEF細胞中擴增HCMV AD169毒株,空斑定量法測定病毒滴度。 3.相差顯微鏡下觀察病毒感染(M0I=5)后HEF和MEF細胞的形態(tài)學改變。 4. RT-PCR、Western-blot、免疫熒光法檢測HCMV-IE、UL84、UL83的表達。 5.MTT比色法檢測HEF和MEF細胞的增殖活性。 6.單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)染色法和透射電鏡檢測胞內自噬體。 7. Western-blot檢測自噬相關蛋白Beclinl和LC3的表達：免疫熒光法檢測LC3的表 達。 結果： 1.成功分離培養(yǎng)并純化原代HEF和MEF細胞,傳代后細胞狀態(tài)良好。 2.用HCMV分別感染HEF和MEF細胞后,HEF細胞第2d逐漸變大變圓并相互融合,第4d超過80%細胞可見典型的HCMV特征性病變效應(CPE),而MEF細胞在相應時間未出現(xiàn)上述的變化。 3. RT-PCR和Western-blot表明HEF細胞表達HCMV-IE1、IE2、UL84和UL83mRNA以及其編碼的蛋白,相對表達量顯著高于正常對照組(P0.01)；而MEF細胞僅表達IE1和IE2mRNA和蛋白,且相對表達量顯著低于HEF細胞(P0.05)。免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)HCMV感染HEF細胞72h表達IE和UL83蛋白,而MEF細胞則無明顯表達。 4.MTT檢測顯示HCMV感染HEF細胞24h內,細胞增殖活性升高,24h后隨著感染時間的延長而降低,而HCMV感染MEF細胞后,96h內細胞增殖活性持續(xù)升高(P0.05)。 5.MDC染色后觀察顯示HEF和MEF細胞感染后24h,多數(shù)核周出現(xiàn)的大量藍綠色的點狀結構,24h后HEF細胞陽性細胞數(shù)逐漸減少,細胞內藍綠色點狀結構密度減弱,而MEF細胞陽性細胞數(shù)和細胞內藍綠色點狀結構密度仍然逐漸增強,明顯高于HEF感染組。 6.透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)HCMV惑染后HEF和MEF細胞漿內均出現(xiàn)大量囊泡狀結構,高倍鏡下可見雙層膜結構,其中包含未完全降解或者已降解的細胞器等。 7. Western-blot吉果顯示,HCMV感染HEF和MEF細胞后Beclin1和LC3-II/LC3-I的相對表達量升高,顯著高于模擬感染組(P0.01)：而HEF細胞在感染24h后逐漸降低,但高于正常對照組(P0.01)；而MEF細胞24hBeclin1和LC3-II/LC3-I的相對表達量逐漸升高,顯著高于HEF組(P0.05)。免疫熒光檢測LC3蛋白結果與Western-blot結果一致。 結論： 1. HCMV在MEF細胞中的復制停滯在IE2基因表達之后和UL84基因表達之前的時相,不能產(chǎn)生完整的子代病毒顆粒。推斷即刻早期蛋白在MEF細胞內的低水平表達可能與HCMV的種屬特異性相關。 2. HCMV感染早期誘導HEF和MEF細胞發(fā)生自噬,但感染后期HEF細胞的自噬效應被抑制,而MEF細胞的自噬并不被明顯抑制。 3. HCMV感染導致HEF和MEF細胞的不同自噬效應可能與病毒編碼蛋白IE之后的蛋白表達相關
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R373

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 趙楊,陳敦金,聞良珍;人巨細胞病毒基因時序表達對感染結局的影響[J];中華微生物學和免疫學雜志;2004年10期

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本文編號：1297516