本文關(guān)鍵詞：靶向LOX-1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

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【摘要】：目的 1、構(gòu)建靶向凝集素樣氧化性低密度脂蛋白受體(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1, LOX-1)基因的RNA干擾(RNA interference, RNAi)慢病毒載體,包裝病毒篩選最佳沉默靶點(diǎn)。 2、研究沉默LOX-1表達(dá)后對(duì)氧化性低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)凋亡的影響。 方法 1、針對(duì)LOX-1基因(OLR1)設(shè)計(jì)并合成3條siRNA干擾靶序列,與雙酶切的線性U6-vshRNA-CMV-GFP慢病毒載體連接得到重組載體,并與包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得慢病毒顆粒,逐步稀釋法測(cè)定病毒滴度。 2、通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得最佳感染指數(shù)(multiplicity of infection, MOI)及轉(zhuǎn)染條件,按照分組：未轉(zhuǎn)染病毒組(CON組),病毒陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組(LV-NC組),病毒陽性轉(zhuǎn)染組(LV-OLR1-RNAi-1組,LV-OLR1-RNAi-2組,LV-OLR1-RNAi-3組)轉(zhuǎn)染HUVECs,轉(zhuǎn)染96h后通過RT-PCR和Western Blotting分別檢測(cè)LOX-1mRNA及蛋白的表達(dá)情況,篩選最佳干擾靶序列。 3、采用方法2中篩選的最佳干擾靶序列,按照分組：正常對(duì)照組,ox-LDL處理組,ox-LDL+LV-NC慢病毒轉(zhuǎn)染組,ox-LDL+LV-OLR1-最佳干擾序列慢病毒轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)染72h后,除外正常對(duì)照組(只加無血清培養(yǎng)基)加入含有ox-LDL(終濃度為150μg/ml)的無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后,采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率及增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western Blotting檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡基因Bcl-2/Bax的表達(dá)情況。 結(jié)果 1、測(cè)序證實(shí),靶向LOX-1RNAi慢病毒載體構(gòu)建成功,測(cè)定病毒滴度為(4-6)×108TU/ml。 2、轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)通過觀察綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)表達(dá)及細(xì)胞生長狀態(tài)得出：MOI=20且在終濃度為5μg/mlPolybrene的條件下細(xì)胞轉(zhuǎn)染96h轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90%以上且細(xì)胞生長狀態(tài)佳,并且GFP持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。 3. RT-PCR和Western Blotting結(jié)果分別從mRNA和蛋白水平顯示LOX-1的表達(dá)在CON組與LV-NC組之間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,病毒陽性轉(zhuǎn)染組與CON組和LV-NC組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),其表達(dá)皆有不同程度的抑制,其中以I_V-OLR1-RNAi-3組的抑制率最高。 4、MTT檢測(cè)結(jié)果顯示給予ox-LDL處理后,未干預(yù)LOX-1表達(dá)組的細(xì)胞存活率較正常對(duì)照組明顯降低,細(xì)胞增殖減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而給予LV-OLR1-RNAi轉(zhuǎn)染預(yù)處理的細(xì)胞再進(jìn)行ox-LDL處理后,細(xì)胞存活率較未干預(yù)LOX-1表達(dá)組明顯升高,細(xì)胞增殖增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果亦顯示給予LV-OLR1-RNAi轉(zhuǎn)染預(yù)處理的細(xì)胞ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯小于未干預(yù)LOX-1表達(dá)組(P0.05)。 5、Western Blotting測(cè)定凋亡蛋白結(jié)果顯示單純給予ox-LDL處理后Bcl-2表達(dá)降低,Bax表達(dá)升高,Bcl-2/Bax比例減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而抑制LOX-1表達(dá)后再給予ox-LDL處理,則Bcl-2表達(dá)升高,Bax表達(dá)降低,Bcl-2/Bax比例增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1、本研究運(yùn)用RNAi技術(shù)成功構(gòu)建靶向LOX-1RNAi慢病毒載體,并有效抑制LOX-1表達(dá)。 2、干擾LOX-1表達(dá)后,可減少ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs的凋亡率,增加其存活率,并通過增加Bcl-2表達(dá),抑制Bax表達(dá),提高Bcl-2/Bax比例來抑制。x-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。
【學(xué)位授予單位】：遼寧醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王春霞;;RNA干擾技術(shù)在臨床中的應(yīng)用[J];臨床醫(yī)學(xué);2009年09期

2 萬春鵬;周壽然;左愛仁;;RNA干擾機(jī)制及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2008年02期

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本文編號(hào)：1288982