本文關(guān)鍵詞：雪膽素甲對(duì)脂多糖活化的巨噬細(xì)胞RAW264.7的炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制研究

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【摘要】：目的： 分析雪膽素甲（cucurbitacin IIa, CuIIa）對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥反應(yīng)的影響，探討其潛在的抗炎效應(yīng)及作用機(jī)制。方法： MTS法檢測(cè)CuIIa對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞增殖的影響，Transwell法檢測(cè)CuIIa對(duì)巨噬細(xì)胞遷移的影響，SDS-聚丙酰胺凝膠電泳法檢測(cè)CuIIa對(duì)細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白G-actin與F-actin的影響。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)CuIIa對(duì)LPS誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子TNF-分泌的影響。相差顯微鏡觀察CuIIa對(duì)活化的巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響，熒光顯微鏡觀察Hoechst33342染色細(xì)胞后細(xì)胞核的形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞亞二倍體（凋亡）峰的變化，免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MAPKs、NF-B、Caspase-3和LC3B-II相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白Actin和自噬相關(guān)蛋白LC3B的分布。結(jié)果： CuIIa能明顯抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞的增殖，并呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。CuIIa能顯著抑制巨噬細(xì)胞遷移（P＜0.05）。CuIIa作用細(xì)胞后，能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生Actin聚集，細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白G-actin聚集為F-actin聚集體。但是CuIIa并不能抑制LPS活化的巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-的分泌（P＞0.05）。同時(shí)CuIIa對(duì)LPS引起的細(xì)胞內(nèi)MAPKs和NF-B炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白的活化作用均未有顯著影響。CuIIa使LPS活化的伸展細(xì)胞收縮變圓，偽足突起消失，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的Actin聚集，說(shuō)明微絲結(jié)構(gòu)被破壞。隨著CuIIa濃度的增加，其誘導(dǎo)LPS活化的RAW264.7細(xì)胞處于Sub-G0/G1（凋亡峰）的數(shù)量明顯增加，但其單獨(dú)作用于細(xì)胞不會(huì)有效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡。免疫印跡分析顯示，，這些效應(yīng)是Caspase-3依賴(lài)的，并伴隨著survivin的下調(diào)。同時(shí)， CuIIa可以增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞自噬，自噬相關(guān)蛋白LC3B-II顯著增加。熒光顯微鏡可以明顯觀察到LPS刺激后細(xì)胞內(nèi)LC3B聚集成點(diǎn)狀分布，CuIIa使這種點(diǎn)狀LC3B的數(shù)量明顯增加。結(jié)論： CuIIa能劑量依賴(lài)性抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞增殖與遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生聚集。雖然CuIIa不能有效的抑制巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子TNF-的分泌和炎癥信號(hào)通路蛋白的活化，但其可以有效的誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡與細(xì)胞自噬。這些可能是其發(fā)揮抗炎效應(yīng)的作用機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1288944