本文關(guān)鍵詞：重組人心肌肌鈣蛋白T的表達及純化

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【摘要】：目的 研究重組人心肌肌鈣蛋白T (Human cardiac troponin T, hcTnT)在大腸桿菌中的表達及純化,為進一步制備cTnT單克隆抗體及開發(fā)穩(wěn)定性良好的hcTnT檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。 方法 1.重組蛋白在大腸桿菌中的表達：將含有hcTnT基因片段的重組質(zhì)粒pET-15b-cTNNT2轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌BL21(DE3)中表達,接種于含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基,在對誘導(dǎo)劑IPTG的誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時間優(yōu)化之后,將細(xì)菌裂解后的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳,鑒定重組蛋白是否在BL21(DE)中正常表達及其表達量,以及確定重組蛋白的可溶性。 2.純化重組蛋白：重組蛋白質(zhì)的N末端含有一個六個組氨酸的親和標(biāo)記,可以和金屬螯合物結(jié)合從而使重組蛋白和其他雜蛋白分離,純化目的蛋白。本實驗中重組蛋白在流過Ni-NTA柱后與柱上的鎳原子結(jié)合,非標(biāo)記蛋白隨流出液流出,經(jīng)過洗脫液洗去大部分雜蛋白,最后可以得到純度較高的重組蛋白。 3. Western-blot鑒定純化后的蛋白是否為重組目的蛋白。 結(jié)果 1.重組質(zhì)粒pET-15b-cTNNT2成功轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌BL21(DE3)中,經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后獲得了較高的表達,用Bandscan5.0軟件檢測發(fā)現(xiàn)重組蛋白的表達量占菌體總蛋白的8%左右。使用羅氏公司Cobas E411電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀檢測也發(fā)現(xiàn)細(xì)菌裂解液中有高濃度的肌鈣蛋白T。 2.利用鎳凝膠柱親和層析法純化重組蛋白,得到了純度較高的重組蛋白。 3.純化得到的蛋白,經(jīng)過Western blot鑒定,在37KD附近有特異性著色帶,與SDS-PAGE中重組蛋白的深染條帶位置相一致,初步證明得到的純化蛋白為重組hcTnT蛋白。 結(jié)論 1.利用基因工程技術(shù)在大腸埃希氏菌BL21(DE3)中成功表達重組hcTnT蛋白。 2.利用鎳凝膠柱親和層析法純化得到了純度較高的重組hcTnT蛋白。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3416

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本文編號：1284078