發(fā)布時間：2017-12-11 10:37

  本文關(guān)鍵詞：維生素D與細胞自噬的相關(guān)性及自噬相關(guān)基因PTEN和AMPK的蛋白表達

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【摘要】：目的：比較檢測組的維生素D(VD)組（VD作用下)的老齡大鼠和正常飲食組老齡大鼠肝臟細胞發(fā)生自噬的程度及兩組大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)因子PTEN和AMPK的蛋白表達以探討VD與自噬的相關(guān)性及VD引起自噬的具體機制，同時對生存曲線組維生素D(VD)作用下的老齡大鼠和正常飲食組老齡大鼠肝臟細胞發(fā)生自噬的程度進行比較，對生存曲線組的VD組和正常飲食組大鼠自然壽命及生存曲線進行分析和比較以探討VD抗衰老的生物學(xué)效應(yīng)。 方法：購買80只24月老齡雄性SD大鼠，先將其隨機分為兩個大組，即檢測組和生存曲線組，然后將兩大組再隨機各分為兩組，即檢測組分為A組（VD組）和B組（正常飲食組），每組各20只，生存曲線組分為A1組(VD組）和B1組（正常飲食組），每組各20只，A組和A1組大鼠在正常飲食的情況下每天同一時間經(jīng)灌胃給予最佳劑量的活性VD(經(jīng)預(yù)實驗得到最佳濃度1.0μg|kg)，B組和B1組在正常飲食的情況下分別用和VD等量的雙蒸水進行灌胃。在VD干預(yù)第100天采集標本，檢測組大鼠需要在活體狀態(tài)下迅速取1mm3肝臟組織，然后放置4℃的冰箱進行保存,最后將檢測組大鼠處死，分別取出各個大鼠的雙側(cè)腎臟組織，經(jīng)生理鹽水數(shù)次沖洗干凈后將其中一個腎臟放于盛有多甲醛的小試管中固定待做免疫組化檢測，另一個用錫紙包裹-80℃保存待做western blot檢測。通過用透射電鏡在不同的倍數(shù)下觀察檢測組的A組和B組肝臟細胞自噬泡的數(shù)量情況以確定各組肝臟細胞的自噬程度，然后進行拍照用統(tǒng)計軟件分析兩組數(shù)據(jù)，對A組和B組的自噬程度進行比較；用免疫組化方法檢測從檢測組的A組和B組大鼠中取出的腎臟PTEN、AMPK的蛋白表達，同樣進行拍照用統(tǒng)計軟件進行分析比較兩組PTEN、AMAPK的蛋白表達量。用western blot方法檢測從檢測組的A組和B組大鼠中取出的腎臟PTEN、AMPK的蛋白表達，，也如上一樣進行拍照用統(tǒng)計軟件進行分析比較兩組PTEN、AMAPK的蛋白表達量。生存曲線組大鼠同樣需要在活體狀態(tài)下取1mm3肝臟組織放置4℃的冰箱進行保存，肝臟取畢后將切口縫合，繼續(xù)喂養(yǎng)，記錄大鼠每天的體重及生理情況直至大鼠自然死亡，記錄生存曲線組A1組和B1組大鼠各組自然死亡大鼠日期。用透射電鏡在不同的倍數(shù)下觀察生存曲線組的A1組和B1組肝臟細胞自噬泡的數(shù)量情況以確定各組肝臟細胞的自噬程度，然后同檢測組一樣進行拍照用統(tǒng)計軟件分析兩組數(shù)據(jù)，對A1組和B1組的自噬程度進行比較。通過軟件對檢測組A1組和B1組繪制生存曲線,然后進行進行生存分析，并對細胞自噬活性和大鼠生存時間進行關(guān)聯(lián)性分析。 結(jié)果：1.在透射電鏡下觀察檢測組和生存曲線組的VD組大鼠肝臟細胞，發(fā)現(xiàn)兩組的細胞都有典型的自噬細胞的形態(tài)學(xué)改變。與正常飲食組相比，VD作用下的大鼠肝臟細胞自噬泡占細胞質(zhì)總面積的比值均明顯提高（P0.01）。2.免疫組化方法示檢測組的VD組大鼠腎臟細胞PTEN和AMPK蛋白表達較正常組顯著升高（P0.01）。3.western blot方法示檢測組的VD組大鼠腎臟細胞PTEN和AMPK蛋白表達較正常組顯著升高（P0.01）。4.利用SPSS18.0軟件對生存曲線組大鼠繪制生存曲線，同時得到統(tǒng)計結(jié)果即細胞發(fā)生自噬的程度和大鼠壽命之間呈線性正相關(guān)(rs=0.880, P0.01)，因此VD可以延長老齡大鼠的壽命。 結(jié)論：1.透射電鏡檢測細胞自噬方法證實VD可增強細胞發(fā)生自體吞噬2.免疫組化方法檢測大鼠腎臟細胞的PTEN和AMPK蛋白表達量也相應(yīng)提高，western blot方法檢測大鼠腎臟細胞的PTEN和AMPK蛋白表達量也相應(yīng)提高，推測VD引起自噬過程中可能與PTEN及AMPK有關(guān)3.VD可以使老齡大鼠壽命延長，VD延長壽命的機制與細胞自噬相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R363

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 盧瑞利;邵經(jīng)浩;郭長青;;自噬相關(guān)基因Beclin1和PTEN在食管癌中的表達和意義[J];臨床薈萃;2009年18期

本文編號：1278167