發(fā)布時(shí)間：2017-12-11 10:37

  本文關(guān)鍵詞：維生素D與細(xì)胞自噬的相關(guān)性及自噬相關(guān)基因PTEN和AMPK的蛋白表達(dá)

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【摘要】：目的：比較檢測組的維生素D(VD)組（VD作用下)的老齡大鼠和正常飲食組老齡大鼠肝臟細(xì)胞發(fā)生自噬的程度及兩組大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)因子PTEN和AMPK的蛋白表達(dá)以探討VD與自噬的相關(guān)性及VD引起自噬的具體機(jī)制，同時(shí)對生存曲線組維生素D(VD)作用下的老齡大鼠和正常飲食組老齡大鼠肝臟細(xì)胞發(fā)生自噬的程度進(jìn)行比較，對生存曲線組的VD組和正常飲食組大鼠自然壽命及生存曲線進(jìn)行分析和比較以探討VD抗衰老的生物學(xué)效應(yīng)。 方法：購買80只24月老齡雄性SD大鼠，先將其隨機(jī)分為兩個(gè)大組，即檢測組和生存曲線組，然后將兩大組再隨機(jī)各分為兩組，即檢測組分為A組（VD組）和B組（正常飲食組），每組各20只，生存曲線組分為A1組(VD組）和B1組（正常飲食組），每組各20只，A組和A1組大鼠在正常飲食的情況下每天同一時(shí)間經(jīng)灌胃給予最佳劑量的活性VD(經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到最佳濃度1.0μg|kg)，B組和B1組在正常飲食的情況下分別用和VD等量的雙蒸水進(jìn)行灌胃。在VD干預(yù)第100天采集標(biāo)本，檢測組大鼠需要在活體狀態(tài)下迅速取1mm3肝臟組織，然后放置4℃的冰箱進(jìn)行保存,最后將檢測組大鼠處死，分別取出各個(gè)大鼠的雙側(cè)腎臟組織，經(jīng)生理鹽水?dāng)?shù)次沖洗干凈后將其中一個(gè)腎臟放于盛有多甲醛的小試管中固定待做免疫組化檢測，另一個(gè)用錫紙包裹-80℃保存待做western blot檢測。通過用透射電鏡在不同的倍數(shù)下觀察檢測組的A組和B組肝臟細(xì)胞自噬泡的數(shù)量情況以確定各組肝臟細(xì)胞的自噬程度，然后進(jìn)行拍照用統(tǒng)計(jì)軟件分析兩組數(shù)據(jù)，對A組和B組的自噬程度進(jìn)行比較；用免疫組化方法檢測從檢測組的A組和B組大鼠中取出的腎臟PTEN、AMPK的蛋白表達(dá)，同樣進(jìn)行拍照用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析比較兩組PTEN、AMAPK的蛋白表達(dá)量。用western blot方法檢測從檢測組的A組和B組大鼠中取出的腎臟PTEN、AMPK的蛋白表達(dá)，，也如上一樣進(jìn)行拍照用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析比較兩組PTEN、AMAPK的蛋白表達(dá)量。生存曲線組大鼠同樣需要在活體狀態(tài)下取1mm3肝臟組織放置4℃的冰箱進(jìn)行保存，肝臟取畢后將切口縫合，繼續(xù)喂養(yǎng)，記錄大鼠每天的體重及生理情況直至大鼠自然死亡，記錄生存曲線組A1組和B1組大鼠各組自然死亡大鼠日期。用透射電鏡在不同的倍數(shù)下觀察生存曲線組的A1組和B1組肝臟細(xì)胞自噬泡的數(shù)量情況以確定各組肝臟細(xì)胞的自噬程度，然后同檢測組一樣進(jìn)行拍照用統(tǒng)計(jì)軟件分析兩組數(shù)據(jù)，對A1組和B1組的自噬程度進(jìn)行比較。通過軟件對檢測組A1組和B1組繪制生存曲線,然后進(jìn)行進(jìn)行生存分析，并對細(xì)胞自噬活性和大鼠生存時(shí)間進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。 結(jié)果：1.在透射電鏡下觀察檢測組和生存曲線組的VD組大鼠肝臟細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩組的細(xì)胞都有典型的自噬細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。與正常飲食組相比，VD作用下的大鼠肝臟細(xì)胞自噬泡占細(xì)胞質(zhì)總面積的比值均明顯提高（P0.01）。2.免疫組化方法示檢測組的VD組大鼠腎臟細(xì)胞PTEN和AMPK蛋白表達(dá)較正常組顯著升高（P0.01）。3.western blot方法示檢測組的VD組大鼠腎臟細(xì)胞PTEN和AMPK蛋白表達(dá)較正常組顯著升高（P0.01）。4.利用SPSS18.0軟件對生存曲線組大鼠繪制生存曲線，同時(shí)得到統(tǒng)計(jì)結(jié)果即細(xì)胞發(fā)生自噬的程度和大鼠壽命之間呈線性正相關(guān)(rs=0.880, P0.01)，因此VD可以延長老齡大鼠的壽命。 結(jié)論：1.透射電鏡檢測細(xì)胞自噬方法證實(shí)VD可增強(qiáng)細(xì)胞發(fā)生自體吞噬2.免疫組化方法檢測大鼠腎臟細(xì)胞的PTEN和AMPK蛋白表達(dá)量也相應(yīng)提高，western blot方法檢測大鼠腎臟細(xì)胞的PTEN和AMPK蛋白表達(dá)量也相應(yīng)提高，推測VD引起自噬過程中可能與PTEN及AMPK有關(guān)3.VD可以使老齡大鼠壽命延長，VD延長壽命的機(jī)制與細(xì)胞自噬相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 盧瑞利;邵經(jīng)浩;郭長青;;自噬相關(guān)基因Beclin1和PTEN在食管癌中的表達(dá)和意義[J];臨床薈萃;2009年18期

本文編號：1278167