本文關(guān)鍵詞：VEGF分別與bFGF、aFGF聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞

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【摘要】：背景 種子細(xì)胞的選擇是進行細(xì)胞組織工程研究的基礎(chǔ)。胚胎干細(xì)胞作為一種全能干細(xì)胞,是最理想的種子細(xì)胞,但是在獲取胚胎干細(xì)胞的過程中需要破壞囊胚,存在倫理學(xué)爭議,并且將胚胎干細(xì)胞移植入個體后會引起免疫排斥并導(dǎo)致畸胎瘤,因而限制了它在科研和臨床中的應(yīng)用。 隨著研究的深入,學(xué)者發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞不存在以上問題,逐漸成為細(xì)胞組織工程研究的熱點。首先,間充質(zhì)干細(xì)胞是一種起源于中胚層間質(zhì)的成體干細(xì)胞,具有自我更新和多向分化潛能,在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下可以向多種細(xì)胞分化,特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細(xì)胞,如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等,并且經(jīng)過體外傳代擴增以后仍然能夠保持這種干細(xì)胞特性。其次,間充質(zhì)干細(xì)胞的來源廣泛,在胎兒及成體的骨髓、骨膜、脂肪、乳牙、臍帶等多種組織中均有存在,分離獲取間充質(zhì)干細(xì)胞不需要破壞囊胚,因而不存在倫理道德問題。再者,間充質(zhì)干細(xì)胞還具有免疫調(diào)節(jié)功能,可以通過細(xì)胞間的相互作用及產(chǎn)生細(xì)胞因子抑制T細(xì)胞的增殖及其免疫反應(yīng),從而發(fā)揮免疫重建的功能,進行自體移植也不存在免疫排斥反應(yīng),并且已經(jīng)有許多研究結(jié)果顯示成體干細(xì)胞治療不會引發(fā)畸胎瘤。 間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中含量最高,但也僅占有核細(xì)胞的0.001%-0.01%。目前分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法主要有：全骨髓貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法和免疫磁珠法,前兩種方法操作簡便,但僅用其中一種方法很難實現(xiàn)細(xì)胞的純化,從而對實驗研究產(chǎn)生不良的影響,后兩種方法分離出來的細(xì)胞純度較高,但操作過程復(fù)雜,費用昂貴,不能得到廣泛推廣。目前多采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選的方法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,但這種方法分離出來的間充質(zhì)干細(xì)胞的純度如何,細(xì)胞經(jīng)過傳代以后的活力是否發(fā)生變化,目前缺乏較為系統(tǒng)而全面的評估。 體內(nèi)、外的許多研究顯示間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在此過程中發(fā)揮主要作用,堿性成纖維細(xì)胞生長因子可以創(chuàng)造有利于間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的微環(huán)境,具有協(xié)同誘導(dǎo)的作用,這兩種因子是目前體外內(nèi)皮化誘導(dǎo)最常用的組合。酸性成纖維細(xì)胞生長因子與堿性成纖維細(xì)胞生長因子的生物學(xué)功能相似,并且在酸性環(huán)境中其生物活性發(fā)揮的更好。在誘導(dǎo)分化過程中,細(xì)胞代謝會引起培養(yǎng)液的PH值降低,酸性成纖維細(xì)胞生長因子有可能更好的協(xié)助血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。 第一章：兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及活力檢測 目的 體外分離出兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,進行形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型及分化潛能的鑒定,并對傳代后細(xì)胞的活力進行檢測和比較。 方法 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化：在無菌條件下抽取兔子股骨和脛骨的骨髓,采取密度梯度離心的方法把骨髓中比重不同的細(xì)胞群分層,然后分離出含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的單個核細(xì)胞,置于37℃、5%C02、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),通過換液去除未貼壁的細(xì)胞,并且在傳代過程中利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易于消化的特點,嚴(yán)格控制胰蛋白酶的量和消化時間,去除貼壁能力較強的單核細(xì)胞及成纖維細(xì)胞,從而實現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純化。 2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定： (1)形態(tài)學(xué)：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞在不同時期的形態(tài)特征,并進行蘇木素—伊紅染色。 (2)細(xì)胞表型：應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測CD14、CD29、CD34、CD44、CD45以及CD90的表達。 (3)分化潛能：應(yīng)用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞,并進行茜素紅染色鑒定鈣質(zhì)結(jié)節(jié)；應(yīng)用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞,并進行油紅O染色鑒定脂肪細(xì)胞。 3、細(xì)胞活力的檢測 (1)描繪細(xì)胞生長曲線：選取P1、P3、P5代生長狀況良好的細(xì)胞以相同細(xì)胞數(shù)量接種于直徑為3.5cm的培養(yǎng)皿內(nèi),自第2d起每天取3個培養(yǎng)皿消化計數(shù),每皿計數(shù)3次,取其平均值,連續(xù)8d。以時間為橫軸,細(xì)胞數(shù)為縱軸,繪制生長曲線。 (2)計算細(xì)胞接種存活率：選取P1、P3、P5代處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,以3.5×107L-1的濃度接種于直徑為3.5cm的培養(yǎng)皿中,每隔2h隨機選取3個培養(yǎng)皿,棄去培養(yǎng)液與未貼壁細(xì)胞,用濃度為0.25%胰蛋白酶消化,計算每個皿內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量,取平均值,計算貼壁率,連續(xù)測定18h,以時間為橫軸,貼壁率為縱軸,繪制曲線。 (3)細(xì)胞克隆形成率：選取P1、P3、P5代處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,消化后以100個/孔接種于6孔板中,連續(xù)培養(yǎng)16d,用臺盼藍染色后計數(shù)細(xì)胞克隆,標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞數(shù)≥50個記為為1個細(xì)胞克隆。 結(jié)果 1、形態(tài)特征：細(xì)胞在培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁生長,原代細(xì)胞的形態(tài)多呈圓形、梭形和三角形,5-6d可形成散在的細(xì)胞集落,8-10d集落之間相互融合,細(xì)胞呈魚群狀排列。經(jīng)過貼壁篩選,細(xì)胞的同質(zhì)性和均一性逐漸提高。 2、細(xì)胞表型：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：細(xì)胞CD29、CD44、CD90的表達率分別為97.21%、98.87%和96.20%；CD14、CD34、CD45表達率分別為5.36%、0.36%和2.03%。 3、分化潛能：成骨誘導(dǎo)21d,實驗組可形成明顯的鈣質(zhì)結(jié)節(jié),茜素紅染色后見鈣結(jié)節(jié)呈深紅色,對照組無明顯改變。成脂誘導(dǎo)14d,實驗組細(xì)胞呈圓形或多邊形,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見明顯脂滴形成,油紅0染色呈現(xiàn)鮮艷的紅色,對照組未見明顯變化。 4、生長曲線：P1、P3代細(xì)胞的生長曲線形態(tài)相似,均呈現(xiàn)出典型的“S”形,相同時間內(nèi)P5代細(xì)胞的增殖速度相對緩慢。 5、細(xì)胞接種存活率：P1、P3代細(xì)胞貼壁率的變化基本一致,接種14h后貼壁率可達到96%,P5代細(xì)胞的貼壁率較P1、P3代細(xì)胞明顯低,接種14h后的貼壁率僅為87%,統(tǒng)計分析提示P1、P3代細(xì)胞貼壁率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),P5代細(xì)胞與P1、P3代細(xì)胞之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 6、細(xì)胞克隆形成率：P1、P3、P5代細(xì)胞均可形成細(xì)胞克隆,顯微鏡下可見克隆內(nèi)的細(xì)胞排列緊密,形態(tài)與原代細(xì)胞近似,克隆周邊可見散在的老化或變異的細(xì)胞。細(xì)胞克隆形成率在P1、P3、P5代細(xì)胞之間的差異具有顯著性(P0.01),隨著傳代次數(shù)增加克隆形成率逐漸降低。 結(jié)論 1、密度梯度離心法能夠分離出具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)過貼壁篩選可以實現(xiàn)細(xì)胞的進一步純化。 2、密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選的方法分離出的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在P1至P3代能夠保持良好的細(xì)胞活力；隨著擴增傳代,細(xì)胞活力會有不同程度的下降。 3、基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程研究適宜在P1至P3代以內(nèi)進行,這樣能夠保證細(xì)胞與支架的良好貼附,為進一步的臨床治療奠定基礎(chǔ)。 第二章：誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞：aFGF與bFGF生物活性的比較 目的 VEGF分別與bFGF、aFGF聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、攝取功能、檢測CD31表達率及NO分泌量鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞,并統(tǒng)計分析兩種因子組合在誘導(dǎo)效率方面的差異。 方法 1、兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定：同第一部分。 2、誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞：選取P3代生長狀況良好的細(xì)胞,接種于6孔板中。實驗組應(yīng)用含VEGF (20ng/ml), aFGF (10ng/ml)的培養(yǎng)液誘導(dǎo),對照組應(yīng)用含VEGF (20ng/ml)、bFGF (10ng/ml)的培養(yǎng)液誘導(dǎo)。 3、血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定 (1)在倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞的形態(tài)變化。 (2)攝取功能：采用攝取Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)和結(jié)合硫氰酸熒光素標(biāo)記的結(jié)合荊豆凝集素(FITC-UEA-1)的雙染色方法進行鑒定。熒光顯微鏡下觀察,攝取Dil-ac-LDL的細(xì)胞散發(fā)出紅色熒光,結(jié)合FITC-UEA-I的細(xì)胞散發(fā)出綠色熒光,熒光染色雙陽性的細(xì)胞呈黃色,是具有攝取功能的內(nèi)皮細(xì)胞。 (3)CD31表達率：兩種因子組合誘導(dǎo)培養(yǎng)第15d和第24d,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD31的表達。 (4)NO分泌量的檢測：誘導(dǎo)第15d和第24d,取上清液,儲存于-80℃冰箱內(nèi)。按照NO檢測試劑盒的說明書進行操作,以平均吸光度OD值為x軸,標(biāo)準(zhǔn)品濃度為y軸,用Excel作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式,將樣品OD值代入公式計算NO濃度。 結(jié)果 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及鑒定：同第一部分。 2、內(nèi)皮細(xì)胞鑒定 (1)形態(tài)學(xué)觀察：經(jīng)過誘導(dǎo)以后,細(xì)胞體積變小,形態(tài)為圓形、橢圓形或短梭形,形態(tài)飽滿,立體感增強。24d后,細(xì)胞呈現(xiàn)典型的“鋪路石”樣表現(xiàn)。 (2)攝取功能：誘導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)過熒光染色,顯微鏡下可見雙染色陽性的細(xì)胞大于50%。 (3)CD31的表達：誘導(dǎo)第15d,實驗組和對照組CD31的表達率分別為(34.20±2.90)%和(46.23±2.87)%,兩樣本t檢驗比較差異具有顯著性(P0.01),對照組的表達率較高；誘導(dǎo)第24d,實驗組和對照組CD31的表達率分別為(53.35±2.12)%和(56.14±3.93)%,兩樣本t檢驗比較差異沒有顯著性(P0.05)。 (4)NO分泌量的檢測：誘導(dǎo)第15d,實驗組和對照組NO的分泌量分別為(70.27±3.45)μmol/L和(79.19±5.34)μmol/L兩樣本t檢驗比較差異具有顯著性(P0.01),對照組NO的分泌量較高；誘導(dǎo)第15d,實驗組和對照組NO的分泌量分別為(105.16±5.89)μmol/L和(109.97±5.99)μmol/,L兩樣本t檢驗比較提示差異沒有顯著性(P0.05)。 結(jié)論 1. VEGF+bFGF和VEGF+aFGF兩種因子組合均可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞,并且兩種方案的最終誘導(dǎo)效率沒有差別。 2、在誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的過程中,bFGF比aFGF更容易受到細(xì)胞代謝活動的影響。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：1271680