本文關(guān)鍵詞：利用GST-pull down方法篩查PAD4相互作用蛋白的初步研究

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【摘要】：GST pull-down法作為蛋白質(zhì)相互作用的體外研究方法之一，簡單、方便、易操作，但研究未知的蛋白質(zhì)相互作用難度較大，少有報道；肽酰基精氨酸脫亞胺酶4（PeptidylArginine Deiminase type IV, PAD4）作為類風濕性關(guān)節(jié)炎（RheumatoidArthritis, RA）易感基因，其介導(dǎo)的組蛋白瓜氨酸化是哺乳類固有免疫 中性粒細胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps, NET）形成的必要條件。PAD4也可以作為共抑制因子下調(diào)抗癌基因P53誘導(dǎo)的下游基因的表達，被認為參與了腫瘤的發(fā)生，，但具體作用機制尚不清楚；PAD4主要在免疫細胞中表達，是五種肽酰基精氨酸脫亞胺酶中唯一具有核定位信號的蛋白多肽瓜氨酸化酶。實驗室通過蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)TNF-α有誘導(dǎo)HL-60細胞中PAD4蛋白核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，PAD4蛋白核轉(zhuǎn)移后分子量變大，推測入核過程中可能與其他蛋白發(fā)生相互作用。明確其核轉(zhuǎn)移時相互作用蛋白及闡明其核轉(zhuǎn)運機制，對于認識PAD4在正常生理狀態(tài)和病變情況下的基因功能具有重要的意義，實驗室選取HL-60細胞，利用GST pull-down assay在這方面進行了初步探索。 目的：構(gòu)建GST-PAD4載體及核定位信號缺失載體GST-PAD4-NLS-，通過優(yōu)化表達條件得到高純度融合蛋白GST-PAD4及GST-PAD4-NLS-，用GST pull-down assay初步尋找PAD4核轉(zhuǎn)移時與之相互作用的蛋白。 方法：用TNF-α處理HL-60細胞，蛋白免疫印跡觀察PAD4在HL-60細胞中核轉(zhuǎn)移，然后構(gòu)建帶有GST標簽的PAD4以及PAD4核定位信號缺失（PAD4-NLS-）的原核表達載體；通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，獲得重組蛋白表達的工程菌，經(jīng)過優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件，獲得重組蛋白的可溶性表達；再利用Sepharose4B親和層析法分別純化出重組蛋白GST-PAD4以及GST-PAD4-NLS-，將純化的重組蛋白分別固定在谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Sepharose4B)上，與來源于HL-60細胞中的總蛋白共同孵育，富集可能與GST-PAD4以及GST-PAD4-NLS-發(fā)生相互作用的蛋白；最后經(jīng)SDS-PAGE聯(lián)合銀染初步尋找可能與PAD4或PAD4-NLS-發(fā)生相互作用的蛋白。 結(jié)果：蛋白免疫觀印跡察到TNF-α有誘導(dǎo)PAD4在HL-60細胞中核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，PAD4入核后分子量變大，TNF-α誘導(dǎo)2h左右PAD4入核現(xiàn)象明顯；優(yōu)化獲得融合蛋白GST-PAD4最佳可溶性表達條件：16°C下菌液OD600約為0.4時加入0.1mM IPTG誘導(dǎo)12h以上，在這一條件下獲得高純度的融合蛋白GST-PAD4以及GST-PAD4-NLS-；利用GST pull-down方法捕獲到PAD4核轉(zhuǎn)移時可能與之相互作用的蛋白并利用SDS-PAGE聯(lián)合銀染的方法進行了初步分析。 結(jié)論：觀察到TNF-α誘導(dǎo)PAD4核轉(zhuǎn)移后有分子量增加的現(xiàn)象；通過優(yōu)化表達條件可以獲得高純度的融合蛋白；利用GST pull-down方法初步篩查到一條與PAD4相互作用的可疑蛋白條帶。為進一步明確其核轉(zhuǎn)移時相互作用蛋白及闡明其核轉(zhuǎn)運機制提供了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：濟南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R3411

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：1265189