本文關(guān)鍵詞：RGD-重組葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白原核表達(dá)、純化及鑒定

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【摘要】：目的構(gòu)建RGD-重組葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒,在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白,純化并初步鑒定其生物學(xué)活性。方法利用重疊延伸PCR獲得目的融合基因片段RGD-r SAK-α1M,插入帶有His-GST標(biāo)簽的原核高效可溶性表達(dá)載體PEGX-6P-1中。經(jīng)酶切鑒定后,將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株,IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),經(jīng)Ni+親和層析柱純化后用3C蛋白酶切除重組蛋白的His-GST標(biāo)簽,再利用DEAE離子交換柱和分子篩純化蛋白。最后應(yīng)用纖維蛋白平板溶圈法和血小板聚集抑制試驗分別測定評價重組融合蛋白的溶栓活性和抗血小板聚集作用。結(jié)果 1)成功構(gòu)建了RGD-重組葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白。2)實現(xiàn)了目的融合蛋白在大腸桿菌上清液中的高效表達(dá),并純化了融合蛋白。3)體外實驗表明純化后的融合蛋白纖溶活性同尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品無明顯差異。4)融合蛋白抗血小板聚集作用較單純重組葡激酶明顯提高。結(jié)論經(jīng)文獻(xiàn)檢索確認(rèn)為首次獲得了純化的RGD-重組葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白,并驗證了其纖溶活性和尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品無明顯差異,而抗血小板聚集作用較單純重組葡激酶增強(qiáng),為下一步進(jìn)行融合蛋白免疫原性鑒定奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科;重慶醫(yī)科大學(xué)感染病性疾病分子生物實驗室;
【基金】：重慶市科委國際合作項目(cstc2012gg-gjhz0025) 重慶市衛(wèi)生局重點項目(20111025) 國家臨床重點專科建設(shè)項目[財社(2011)170號]
【分類號】：R3411
【正文快照】： 葡激酶(staphylokinase,SAK)作為臨床溶栓治療的一線用藥,是由金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體合成的一種蛋白質(zhì),不僅具有高效的纖溶活性和纖維蛋白專一性,且不會引起全身纖溶亢進(jìn)[1],免疫原性及血管開通后再梗塞是限制其臨床使用的主要原因[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)利用基因融合構(gòu)建的融合

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【相似文獻(xiàn)】

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本文編號：1264810