本文關鍵詞：姜黃素經(jīng)mTOR信號通路增強骨髓間充質干細胞的抗氧化應激作用

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【摘要】：骨髓間充質干細胞（BMSC）因其強大的增殖能力和較強的多向分化潛能，而且不涉及到倫理學問題，又具有取材方便、便于自體移植、外源性基因轉染等優(yōu)點，是組織工程的理想種子細胞，因此越來越受到人們關注。BMSC現(xiàn)在已被用于一些臨床疾病的細胞移植治療，比如骨發(fā)育不全、急慢性移植物抗宿主反應疾病、炎性腸病、缺血性心臟病、未愈合性潰瘍、缺血性發(fā)作以及帕金森病等。盡管細胞治療為許多臨床疾病的治療帶來了新希望，提供了一種新的治療手段，然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)移植入缺血區(qū)MSC的存活率非常低，移植24h后，大約99%的BMSC發(fā)生凋亡［1］。因此，干細胞存活率低下成為了細胞移植技術發(fā)展的關鍵障礙。 損傷局部的缺血缺氧微環(huán)境和炎癥環(huán)境（中性粒細胞和巨噬細胞是ROS最主要的來源）均能引起活性氧復合物(reactive oxgenspecieces，ROS)的釋放，體內(nèi)活性氧的大量堆積可以促使細胞凋亡、壞死和組織損傷。體內(nèi)ROS主要包括:超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫(H2O2)等，通過激活許多信號傳導通路來導致細胞損傷。為此，增強干細胞的抗氧化損傷能力是解決移植BMSC存活率低的關鍵問題。 在氧化應激的多條通路中，mTOR（雷帕霉素靶蛋白）通路發(fā)揮著重要的作用，mTOR通路是介導細胞生長和阻止細胞死亡的重要的信號轉導通路,同時參與細胞凋亡的調控[2]，研究顯示mTOR信號的小分子抑制劑可以通過降低Mcl-1的表達和增加磷酸化的Bim的表達來促進凋亡。由于Bim可以直接刺激Bax和Bak的活化，并且間接的與抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1結合，Bim表達水平的上調抑制了mTOR信號通路的活化，最終導致促/抗凋亡蛋白失衡，從而發(fā)生凋亡[3]。 姜黃素作為食物香料的主要成分被人們所熟知，它是一種從中藥姜黃中提取的天然產(chǎn)物石榴籽多酚，由于其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗淀粉樣變性等廣泛的藥理作用而被臨床運用于治療多種慢性疾病，如阿爾茨海默�。ˋD）、帕金森疾病、多發(fā)性硬化，癲癇、腦損傷、腦損傷、糖尿病和艾滋病等，，并取得一定的療效。目前公認的姜黃素作用機理主要有：①抗氧化作用：氧化損傷是BMSCs移植治療時所遭遇最主要的有害刺激之一。姜黃素是一種天然的抗氧化劑，其含有的酚性羥基可以直接捕獲或清除自由基，其清除自由基能力甚至高于維生素②抗炎癥反應：炎癥反應也是造成干細胞移植損傷的原因之一。體外實驗表明，姜黃素能夠清除自由基，并使細胞免于脂類及蛋白質過氧化反應造成的損害。但是BMSCs在氧化損傷的環(huán)境下，姜黃素能否通過mTOR通路來發(fā)揮抗氧化應激作用未見相關報道。 為此，本實驗通過H2O2建立BMSCs的氧化應激模型，觀察BMSCs在不同濃度的H2O2刺激下的形態(tài)學和病理學變化，采用MTT檢測不同濃度H2O2對BMSCs增殖的影響。用Western blot等檢測方法，探討B(tài)MSCs在氧化應激中mTOR信號通路和凋亡蛋白的表達變化，以及姜黃素干預后中，通過調節(jié)mTOR信號通路和凋亡蛋白的變化來減輕氧化應激性刺激對BMSCs的損傷的機制。最終為細胞的抗氧化治療提供新的實驗依據(jù)和思路。 第一部分：mTOR信號通路及凋亡相關蛋白在BMSCs氧化應激中的作用方法 1. BMSCs分離、培養(yǎng)與鑒定 2. BMSCs氧化應激模型的建立：實驗分組：對照組（BMSCs常規(guī)培養(yǎng)）和氧化應激損傷組（BMSCs常規(guī)培養(yǎng)+100、200、300、400、500、800、1000μmol/L H2O2）損傷組（n=5） 3.氧化應激性刺激對BMSCs的損傷 倒置相差顯微鏡觀察對照組和損傷組H2O2處理24h后的BMSCs的形態(tài)學改變。 MTT法檢測在對照組和損傷組H2O2處理24h、48h、72h小時后，H2O2對BMSCs的增殖抑制作用。 熒光顯微鏡觀察H2O2處理BMSCs24h后的hochest33342染色核的凋亡形態(tài)學改變。 4. western blot檢測H2O2處理BMSCs后mTOR、p70s6k、s6蛋白以及蛋白磷酸化的表達。 5. western blot檢測H2O2處理BMSCs后的Bax、Bcl-2蛋白表達水平。 6.實驗所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD檢驗。 結果 1.100～1000μmol/L濃度的H2O2處理mBMSCs24h后，其形態(tài)學發(fā)生病理學的濃度依賴性改變。 2. MTT檢測結果顯示：隨著H2O2的濃度及作用時間的增加，BMSCs的死亡數(shù)量相應增加。 3. hochest33342染色顯示：隨著H2O2濃度的增加，細胞核的凋亡形態(tài)增多，與對照組相染色結果比，H2O2濃度在500～1000μmol/L時，凋亡細胞數(shù)量顯著增多。 4. H2O2濃度在100～300μmol/L時，隨著H2O2濃度的遞增，mBMSCs的mTOR、P70S6K、S6蛋白的表達有增高的趨勢，其磷酸化表達也明顯增加（P㩳0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平也增加明顯（P㩳0.01），凋亡蛋白Bax的表達水平不明顯（P㧐0.05）。 5. H2O2濃度在400μmol/L以上時，隨著H2O2濃度的遞增，p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、BCL-2的表達水平降低（P㩳0.05，P㩳0.01），而mTOR、P70S6K、S6表達變化不明顯，同時Bax的蛋白表達明顯增高（P㩳0.01）。 結論 氧化應激性刺激可以使mBMSCs的存活率降低，促使細胞凋亡，其機理可能與氧化損傷抑制mTOR及其下游信號通路的活性，特別是抑制蛋白的磷酸化有關；同時也與抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，增加凋亡蛋白Bax表達有關。 第二部分：姜黃素在BMSCs氧化應激性刺激中的作用及機制 方法: 1.實驗分組：1）對照組（BMSCs常規(guī)培養(yǎng)，不加任何額外刺激），2）氧化應激損傷組（對照組+500μmol/L H2O2），3）姜黃素組（3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L姜黃素干預），4）雷帕霉素+姜黃素組（氧化應激組+50ng/mL的雷帕霉素+12.5μmol/L姜黃素）。 2. MTT法檢測不同濃度姜黃素對BMSCs的抗氧化作用。 3. western blot檢測經(jīng)各組處理后BMSCs的Bax、Bcl-2蛋白表達水平，mTOR及其下游信號通路p70s6k、s6磷酸化蛋白的表達變化. 7.實驗所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD檢驗。 結果 1. MTT檢測結果顯示：在12.5μmol/L的姜黃素濃度時發(fā)揮最大抗氧化應激作用。 2.12.5μmol/L姜黃素組與氧化應激損傷組相比,p-mTOR、p-P70S6K、p-S6的表達水平增高（P㩳0.01）；mTOR信號通路阻斷劑雷帕霉素可以明顯阻斷這一作用（P㩳0.01）。 3.12.5μmol/L姜黃素組與氧化應激損傷組相比,Bcl-2的表達水平上調，Bax的表達水平下調（P㩳0.01）；mTOR信號通路阻斷劑雷帕霉素可以明顯阻斷這一作用（P㩳0.01）。 結論 一定濃度的姜黃素可以發(fā)揮抗氧化應激作用，其機制可能與活化mTOR通路，促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達，降低促凋亡蛋白Bax表達密切相關。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 韓冰;;亮氨酸對肌源衛(wèi)星細胞mTOR信號通路的影響[J];食品科學;2013年19期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 崔明亮;心內(nèi)膜下移植骨髓單個核細胞和間充質干細胞對豬急性心肌梗死療效的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學;2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 孫豫蘭;mTOR信號途徑在兒童再生障礙性貧血T細胞中異�；罨某醪窖芯縖D];蘇州大學;2013年

2 卜一;mTOR、FKBP38在SOD1-G93A轉基因小鼠中的研究[D];河北醫(yī)科大學;2013年

3 任倩;雷帕霉素抑制鎘誘導小鼠腦神經(jīng)細胞氧化應激和mTOR通路激活抗凋亡機理研究[D];南京師范大學;2013年

本文編號：1251998