本文關(guān)鍵詞：RACK1蛋白與CLIC1蛋白的相互作用

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【摘要】：目的通過(guò)間接免疫熒光法，免疫共沉淀法，觀察在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中活化的蛋白激酶C受體1(RACK1)蛋白和氯離子胞內(nèi)通道1(CLIC1)蛋白的表達(dá)與定位，驗(yàn)證在體內(nèi)是否存在相互作用，，利用GST-Pulldown法研究?jī)傻鞍自隗w外是否存在相互作用。 方法設(shè)計(jì)RACK1的上下游引物，以RACK1的全長(zhǎng)cDNA序列為模板，PCR擴(kuò)增出RACK1序列，構(gòu)建到pCDNA3.1(+）真核表達(dá)載體和GST原核表達(dá)載體中。酶切鑒定正確的pCDNA3.1-FLAG-RACK1、 pCDNA3.1-HA-RACK1及GST-RACK1重組質(zhì)粒送到生工公司測(cè)序。經(jīng)BLAST比對(duì)，測(cè)序正確的pCDNA3.1-FLAG-RACK1或pCDNA3.1-HA-RACK1和pCDGFP-CLIC1分別轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞。觀察各自空間分布，再共轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞，觀察在RACK1與CLIC1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況。轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-FLAG-RACK1到HEK293T細(xì)胞，利用Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，并與pCDGFP-CLIC1共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，用免疫共沉淀驗(yàn)證兩者是否存在相互作用。GST-RACK1轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，制備融合蛋白，同時(shí)轉(zhuǎn)染pCDGFP-CLIC1到293T細(xì)胞通過(guò)GST-Pulldown技術(shù)檢測(cè)兩者在體外相互作用情況。 結(jié)果酶切鑒定與公司測(cè)序的結(jié)果表明重組質(zhì)粒pCDNA3.1-FLAG-RACK1、pCDNA3.1-HA-RACK1與GST-RACK1構(gòu)建成功。熒光顯微鏡檢測(cè)RACK1與CLIC1蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布，并且兩者在COS7細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中存在重疊分布。Western blot法檢測(cè)到RACK1蛋白在239T細(xì)胞中表達(dá)，免疫共沉淀法證明帶FLAG標(biāo)簽的RACK1蛋白可以把CLIC1蛋白沉淀下來(lái)，在適當(dāng)濃度IPTG誘導(dǎo)下，GST-RACK1融合蛋白表達(dá)成功，GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了體外條件下RACK1蛋白能夠把CLIC1蛋白下拉下來(lái)。 結(jié)論間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明了RACK1蛋白和CLIC1蛋白在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中存在共定位，免疫共沉淀和GST-pulldown實(shí)驗(yàn)證明了RACK1蛋白和CLIC1蛋白在體外和細(xì)胞內(nèi)都存在相互作用。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;R3411

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 安寧;朱文;馮志華;葉蘇娟;余川江;蔡春季;;人參皂苷Rg3對(duì)肺癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響研究[J];中國(guó)肺癌雜志;2008年03期

2 王娟;楊雪艷;王紅艷;張敏;;Vangl2及其相關(guān)基因與神經(jīng)管畸形的關(guān)系[J];生命的化學(xué);2010年05期

3 李榮寬;唐建武;張軍;張宇虹;王紹清;王波;王梅;李妙玲;陳文靜;金艷玲;王靜文;魏元怡;;shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染抑制氯離子通道蛋白1基因的表達(dá)對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞的影響[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2010年06期

本文編號(hào)：1250867