發(fā)布時(shí)間：2017-12-04 10:23

  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復(fù)序列的BHK-21細(xì)胞沉默病毒復(fù)制研究

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【摘要】：登革病毒(dengue rivus, DENV)屬于黃病毒科(Flavivirade)黃病毒屬(Flavi virus),由其感染所引起的疾病包括：登革熱(dengue fever, DF),登革出血熱(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克綜合癥(dengue shock syndrome, DSS)。嚴(yán)重的登革出血熱(登革出血熱和登革休克綜合癥),20世紀(jì)50年代在菲律賓和泰國(guó)登革熱流行期間被首次確認(rèn)。截止至2012年11月WHO報(bào)告,近幾十年來(lái),世界各地的登革熱發(fā)病率大幅增長(zhǎng)。世界上二分之一的人口,非洲,美洲,東地中海,東南亞和西太平洋地區(qū)超過(guò)100個(gè)國(guó)家處于登革熱流行的威脅中,2008年,美洲、東南亞和西太平洋地區(qū)的國(guó)家登革熱病毒感染報(bào)告病例數(shù)120萬(wàn),而到2010年,報(bào)告病例數(shù)上升至230萬(wàn),最近報(bào)告病例仍在持續(xù)增加[2]。登革熱不僅發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì),而且暴發(fā)疫情的地區(qū)也呈擴(kuò)大化的趨勢(shì),以前從未發(fā)現(xiàn)過(guò)登革熱疫情的國(guó)家遭受登革病毒的威脅。登革熱在2012年被WHO列為傳播速度最快的媒介傳播病毒性疾病,它具有在世界上出現(xiàn)流行的可能性。全世界需要改變應(yīng)對(duì)方式,并實(shí)施可持續(xù)性預(yù)防措施。登革熱成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。 目前控制登革熱的方法主要是用化學(xué)方法控制傳播媒介,這種方法對(duì)登革病毒的預(yù)防和控制發(fā)揮了舉足輕重的作用。然而,隨著殺蟲(chóng)劑等化學(xué)制劑的廣泛應(yīng)用,這種方法亦產(chǎn)生許多的負(fù)面影響：蚊蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥基因,破壞環(huán)境—化學(xué)制劑殘留于環(huán)境中。同時(shí),由于熱帶和亞熱帶地區(qū)城市化進(jìn)程加快以及國(guó)際間交流的增加導(dǎo)致白紋伊蚊活動(dòng)范圍擴(kuò)大[5-7],登革病毒的疫區(qū)產(chǎn)生擴(kuò)大化趨勢(shì)。因而,有學(xué)者指出,應(yīng)對(duì)登革病毒傳播需要有效的新策略。如加緊致力于新型有效疫苗的研發(fā),通過(guò)基因修飾或操縱傳播媒介等。通過(guò)基因修飾傳播媒介,改變病毒感染的宿主易感性,從而達(dá)到媒介中病毒復(fù)制的降低或消除,這種方法稱為源于病原體的抵抗(pathogen-derived resistance, DPR)[8-9]。 DPR最早在植物中發(fā)現(xiàn),合成的煙草花葉病毒外殼蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)有效地保護(hù)了植物來(lái)自同源病毒的攻擊。這種現(xiàn)象后來(lái)被命名為RNA干擾效應(yīng)。RNA干擾是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象,RNAi被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于生物界,從低等原核生物、真菌、無(wú)脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了此種現(xiàn)象。RNAi抗病毒的效應(yīng)已在多種媒介昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn),Ronald P. van Rij[10]等發(fā)現(xiàn),黑腹果蠅中RNAi途徑中關(guān)鍵酶Ago-2缺陷株體內(nèi)病毒RNA呈高水平累積；Vargas[11]等通過(guò)敲除RNAi途徑中的AGO-2、Dcr-2和R2D2的表達(dá)后,能增加登革Ⅱ型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制。有研究者已開(kāi)始利用RNAi干擾的技術(shù)修飾或改造媒介,使得媒介減少攜帶或者不攜帶病毒。Anthony KG等通過(guò)引入dsRNA已成功用于抑制西尼羅河病毒(WNV)、日本腦炎病毒(JEV)和黃熱病毒(YFV)的復(fù)制；Franz AW等經(jīng)短片段RNA (short interfering RNA, siRNA)改造的轉(zhuǎn)基因蚊有效地阻止病毒的感染和傳播；Zhang等通過(guò)腺病毒載體轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),對(duì)DENV-2復(fù)制產(chǎn)生干擾效應(yīng),抑制病毒的復(fù)制。RNAi有望成防控登革病毒感染的新策略。 登革病毒的基因組為單股正鏈RNA分子,約含11000個(gè)堿基,具有單一的可讀框,編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白和七種非結(jié)構(gòu)蛋白,其編碼基因順序?yàn)椋?'-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3'。其中prM蛋白的切割被認(rèn)為是未成熟病毒顆粒向成熟病毒顆粒轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟,與病毒的裝配、成熟和維持病毒的感染性有關(guān)。因而,prM被許多研究者選為觸發(fā)RNAi的效應(yīng)基因。成功介導(dǎo)RNAi還需穩(wěn)定高效的表達(dá)系統(tǒng)。質(zhì)粒作為載體導(dǎo)入效應(yīng)基因有以下優(yōu)點(diǎn)：可以使用不同的選擇性標(biāo)志；通過(guò)構(gòu)建可誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng),可長(zhǎng)期穩(wěn)定進(jìn)行基因表達(dá)；進(jìn)行大規(guī)�；蚝Y選的成本低。本研究利用能在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)的真核表達(dá)載pcDNA3.1(+),把登革Ⅱ型病毒前膜蛋白反向重復(fù)序列克隆到該表達(dá)載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至登革病毒易感性高的BHK-21中初步探討干擾病毒復(fù)制的效果,半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析評(píng)價(jià)其抑制病毒復(fù)制的效果,為防控登革病毒感染的新策略提供一定的理論基礎(chǔ)。 目的： 1.構(gòu)建RNAi表達(dá)載體：將登革Ⅱ型病毒前膜蛋白反向重復(fù)序列克隆至能在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(＋)中。 2.構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP,轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。 3.轉(zhuǎn)染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復(fù)序列至BHK-21細(xì)胞,半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR評(píng)價(jià)重組質(zhì)粒抑制病毒復(fù)制的效果。 方法： 1.乳鼠內(nèi)接種登革Ⅱ型病毒,提取病毒total RNA。 2.正義和反義引物兩端分別加上Xho I和EcoR I的識(shí)別位點(diǎn),以提取的totalRNA為模板,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增的prM全長(zhǎng)基因片段插入pcDNA3.1(+)中,形成含有prM反向序列的重組質(zhì)粒pcDNA-asprM。 3.于另一對(duì)正義和反義引物兩端引入酶切位點(diǎn)NheⅠ和BglⅡ,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增prM全長(zhǎng)基因片段插入pMD18-T-vector中,形成含有正向序列的重組質(zhì)粒pMD18-T-prM。 4.限制性內(nèi)切酶NheⅠ和Kpn I分別酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-prM和重組質(zhì)粒pcDNA-asprM,得到片段prM和線性化載體pcDNA-asprM,連接構(gòu)建成含有prM反向重復(fù)序列的重組質(zhì)粒pcDNA-irRNA。 5.擴(kuò)增增強(qiáng)型熒光蛋白基因片段(eGFP),克隆至pcDNA3.1(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP。 6.重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,觀察轉(zhuǎn)染效率。 7.BHK-21細(xì)胞繁殖登革Ⅱ型病毒,收集病毒液。 8.免疫熒光檢測(cè)登革病毒感染BHK-21細(xì)胞。 9. TCID50方法測(cè)定收集的病毒液滴度。 10.篩選的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pcDNA-irRNA和空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中。 11.登革Ⅱ型病毒攻擊細(xì)胞,染毒后不同時(shí)間收集細(xì)胞total RNA。 12.半定量PCR檢測(cè)NS3基因的表達(dá),以評(píng)估病毒復(fù)制水平。 13.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒載量,評(píng)估細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制水平。 14.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NS1基因表達(dá),評(píng)估病毒復(fù)制水平。 結(jié)果： 1.收集接種登革Ⅱ型病毒乳鼠鼠腦病毒液并提取病毒RNA。 2. RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增前膜蛋白全長(zhǎng)基因,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,可見(jiàn)單一條帶,擴(kuò)增效果較好,其大小約600bp,與理論值基本相符,測(cè)序結(jié)果提交至NCBI進(jìn)行比對(duì),同源性達(dá)97%。 3.構(gòu)建的重組載體pMD18-T-prM, pcDNA-asprM和含有prM反向重復(fù)序列的重組質(zhì)粒pcDNA-irRNA,經(jīng)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切均可見(jiàn)特異的酶切條帶。 4.成功擴(kuò)增增強(qiáng)型熒光蛋白基因eGFP序列,經(jīng)測(cè)序證實(shí)重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP中的eGFP cDNA序列與質(zhì)粒pEGFP-N質(zhì)粒(Gene blank accession:#U55762)中的EGFP cDNA序列一致,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP。 5.成功在本室建立登革Ⅱ型病毒感染BHK-21細(xì)胞模型,收集病毒液經(jīng)TCID50測(cè)得的滴度為106.48TCID50/0.1ml。 6.重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP轉(zhuǎn)染BHK-21后,在細(xì)胞內(nèi)有增強(qiáng)型熒光蛋白表達(dá),并初步測(cè)定轉(zhuǎn)染率：在24h、48h、72h和96h轉(zhuǎn)染率分別為36.3%、45.0%、31.6%和31.3%。 7.在不同時(shí)間點(diǎn)收集經(jīng)DENV-2攻擊的實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中的RNA,半定量PCR檢測(cè)NS3mRNA的表達(dá)。擴(kuò)增的NS3基因電泳帶存在明顯差異。Glyko BandScan分析NS3和內(nèi)參GAPDH灰度的比值,結(jié)果顯示,48hpi和60hpi,實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的NS3mRNA表達(dá)量基本相同,在96hpi,實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組間mRNA表達(dá)量存在差異,實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的NS3表達(dá)水平比陽(yáng)性對(duì)照組降低28%。 8.建立熒光定量PCR檢測(cè)DENV2的方法：擴(kuò)增NS1基因和內(nèi)參GAPDH,陽(yáng)性擴(kuò)增曲線整體平行性好,基線平坦,曲線光滑,拐點(diǎn)清楚,呈S形,重復(fù)性好；收集的溶解曲線峰型單一,只有一個(gè)主峰。表明所采用的反應(yīng)體系和引物的擴(kuò)增效率、特異性和模板的量都是合適的；利用登革Ⅱ型病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因,構(gòu)建了檢測(cè)登革Ⅱ型病毒的標(biāo)準(zhǔn)品,在標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上,可以檢測(cè)出待測(cè)標(biāo)本中病毒的拷貝數(shù)。 9.在不同時(shí)間點(diǎn)收集經(jīng)DENV-2攻擊的實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組BHK-21細(xì)胞中的RNA,應(yīng)用FQ-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒載量的變化。結(jié)果顯示,在48hpi內(nèi),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)病毒載量變化不大,在72hpi,兩組細(xì)胞內(nèi)病毒載量達(dá)到峰值,但實(shí)驗(yàn)組病毒量與對(duì)照組相比,病毒拷貝數(shù)少1.44倍。在96hpi,實(shí)驗(yàn)組病毒載量比陽(yáng)性對(duì)照組病毒載量降低26.7%。 10.在不同時(shí)間點(diǎn)收集經(jīng)DENV-2攻擊的實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組BHK-21細(xì)胞中的RNA,應(yīng)用FQ-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NS1表達(dá)水平的差異。歸一化值結(jié)果顯示病毒感染96h后,實(shí)驗(yàn)組中NS1表達(dá)量與陽(yáng)性對(duì)照組比較顯著降低(P0.05),其余兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(48h、60h)NS1表達(dá)量的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： 成功克隆登革Ⅱ型病毒前膜蛋白反向重復(fù)序列的重組質(zhì)粒；登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復(fù)序列具有干擾病毒復(fù)制的效果；為登革病毒基因疫苗的研究提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373.33

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 徐麗華;劉春雷;常玉梅;梁利群;劉金亮;高國(guó)強(qiáng);韓啟霞;;雙標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量PCR試驗(yàn)原理與方法[J];生物技術(shù)通報(bào);2011年01期

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本文編號(hào)：1250684