本文關(guān)鍵詞：MurA蛋白的表達(dá)及其多抗用于免疫磁珠富集單增李斯特菌的快速檢測(cè)

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【摘要】：目的：?jiǎn)卧隼钏固鼐砻娴鞍譓urA可作為檢查的標(biāo)志分子，原核表達(dá)MurA，制備鼠多克隆抗體，將抗體與磁珠偶聯(lián)制成單增李斯特菌免疫磁珠，將免疫磁珠富集技術(shù)結(jié)合選擇性平板培養(yǎng)法，建立免疫磁珠-選擇性平板快速檢測(cè)技術(shù)，以縮短增菌耗時(shí)和提高特異性。 方法：設(shè)計(jì)MurA蛋白的基因引物，PCR擴(kuò)增后，將MurA基因插入原核表達(dá)載體pET28a(+)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化，質(zhì)譜分析后免疫小鼠，制備抗MurA的多克隆抗體；通過(guò)間接ELISA方法，分析多抗效價(jià)及交叉性；用多抗制備MurA特異性免疫磁珠，建立單增李斯特菌免疫磁珠-選擇性培養(yǎng)基檢測(cè)方法，并對(duì)人造污染牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：上清中見(jiàn)72kD的可溶性誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定其為MurA蛋白；3次免疫小鼠后，MurA抗血清效價(jià)達(dá)1:10000，，與傷寒沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、大腸桿菌及屬內(nèi)其它病原菌均無(wú)交叉反應(yīng)，顯示了良好的特異性；用該抗血清制備的免疫磁珠結(jié)合選擇性培養(yǎng)基檢測(cè)法。單增李斯特菌濃度≥103CFU/mL均能檢出，與英諾克李斯特菌存在輕微交叉反應(yīng)；僅需9h增菌可檢出牛奶樣品，較傳統(tǒng)方法可將增菌時(shí)間縮短39h，減少3/4以上的耗時(shí)；檢測(cè)限為0.4CFU/mL。 結(jié)論：成功表達(dá)并經(jīng)鎳柱純化得到高純度的單增李斯特菌MurA蛋白，制備的鼠源抗MurA多克隆抗體親和力高，特異性好；將制備的免疫磁珠結(jié)合選擇性培養(yǎng)基法快速檢測(cè)方法，24h內(nèi)完成對(duì)牛奶樣品的檢測(cè)，較國(guó)標(biāo)法減少42h（3/4）以上。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

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本文編號(hào)：1248550