本文關(guān)鍵詞：SD大鼠大腦皮質(zhì)EAN三細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)空泡化現(xiàn)象觀察及結(jié)果分析

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【摘要】：目的：隨著人口老齡化加劇和群眾生活方式的改變，大腦疾病發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)。雖然治療該類疾病的藥物研發(fā)較多，但是由于許多藥物不能夠通過(guò)血腦屏障或通過(guò)率較低從而達(dá)不到控制疾病的效果。因此大腦疾病的治療及其預(yù)防已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界一大難題。我們?cè)囵B(yǎng)Sprague Dawley（SD）大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial cells, E）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrogcyte,A）和神經(jīng)元（Neuron, N）并利用Transwell系統(tǒng)建立EAN三細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型，嘗試為治療大腦疾病研究提供新的有效工具。本次實(shí)驗(yàn)室在EAN三細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型基本建立成功的基礎(chǔ)上，針對(duì)該模型建立過(guò)程中出現(xiàn)的不穩(wěn)定性因素進(jìn)行觀察和結(jié)果分析，完善模型建立的條件和方法，從而建立一種更加完善穩(wěn)定的體外系統(tǒng)模型，為大腦疾病機(jī)制研究提供更可靠、更理想的新方法，對(duì)新藥物的研發(fā)和篩選提供新的評(píng)價(jià)體系。 方法：1、本次實(shí)驗(yàn)首先提取原代SD大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元，并分別用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidicprotein,GFAP）、血管性血友病因子（von Willebrand Factor protein, vWF）和微管相關(guān)蛋白2（Microtubule-associated protein2, MAP2）相關(guān)抗體對(duì)以上單獨(dú)培養(yǎng)的三種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色以及DAPI細(xì)胞核染色，進(jìn)一步鑒定細(xì)胞的純度。2、然后將三種不同時(shí)間提取的原代細(xì)胞按照一定的時(shí)間空間順序先后種植于包被膠原蛋白Ⅳ的Transwell系統(tǒng)中，建立EAN三細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型系統(tǒng)。3、EAN三細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型系統(tǒng)建立后，測(cè)量模型從共培養(yǎng)開始每天跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值（Trans-endothelial electrical resistance, TEER）及共培養(yǎng)第5天熒光素鈉滲透性系數(shù)(Permeability NaF, Pe NaF)，對(duì)EAN三細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接形成結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)觀察。4、針對(duì)每次實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的不穩(wěn)定性問(wèn)題，整理總結(jié)以往7次原始數(shù)據(jù)及圖片，使用相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和圖像分析軟件Image-Pro-Plus6.0(IPP)對(duì)其不穩(wěn)定因素測(cè)量及結(jié)果分析。 結(jié)果：1、我們成功提取原代SD大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元，并初步建立了EAN三細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型。2、測(cè)量不同模型共培養(yǎng)5天后的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值和熒光素鈉滲透性系數(shù)。EAN、EA、EN和E的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值分別是22.77±1.71×cm2、19.47±1.4×cm2、11.55±0.93×cm2和8.42±1.63×cm2。EAN、EA、EN和E熒光素鈉數(shù)值依次是45.05×106cm/s、76.08×106cm/s、52.1×106cm/s和167.1×106cm/s。3、總結(jié)7次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了含有空泡現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)4次、模型建立后測(cè)量跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值3次，模型建立后測(cè)量熒光素鈉滲透性系數(shù)4次。經(jīng)IPP軟件對(duì)第3次、第5次、第6次和第7次的原始圖片測(cè)量分析，得出結(jié)果四次空泡與細(xì)胞的數(shù)量比總和依次為0.7734、9.2202、16.9858和0.455，空泡與細(xì)胞的面積比的總和依次為0.00629、0.0397、0.09577和0.002004；測(cè)量第4次、第5次第7次EAN三細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出最高的電阻值分別為49.25×cm2，22.77×cm2和47.28×cm2；測(cè)量第3次、第4次、第5次、第7次EAN三細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型建立后熒光素鈉滲透性系數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果依次為44.4×106cm/s，39.7×106cm/s，42.5×106cm/s和40.76×106cm/s。 結(jié)論：1、SD大鼠大腦皮質(zhì)EAN三細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型所測(cè)的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻高于其他細(xì)胞培養(yǎng)模型，所測(cè)的熒光素鈉滲透性系數(shù)低于其他細(xì)胞培養(yǎng)模型，因此推斷EAN三細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型的建立比其他模型更接近體內(nèi)的大腦內(nèi)環(huán)境。2、在模型構(gòu)建過(guò)程中發(fā)現(xiàn)單獨(dú)培養(yǎng)原代內(nèi)皮細(xì)胞有時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)空泡現(xiàn)象，跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值和熒光素鈉滲透性系數(shù)的數(shù)值不穩(wěn)定的現(xiàn)象。3、單獨(dú)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)了空泡現(xiàn)象可能對(duì)整個(gè)模型建立后出現(xiàn)跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值偏低及熒光素鈉滲透性系數(shù)偏低有影響。下一步實(shí)驗(yàn)應(yīng)盡量完善內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的方法，保證毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)，糾正這些不穩(wěn)定因素，從而建立一種更加完善、穩(wěn)定的體外系統(tǒng)模型，對(duì)新藥物的研發(fā)和篩選提供新的評(píng)價(jià)體系，為大腦疾病研究提供有效的工具。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 井慶川;趙靜;趙寶祥;張尚立;苗俊英;;利用γ-丁內(nèi)酯衍生物研究空泡化與細(xì)胞分化[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版);2008年03期

2 陳圣敏;;幽門螺桿菌空泡毒素VacA致病機(jī)制研究[J];中西醫(yī)結(jié)合研究;2010年01期

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本文編號(hào)：1247701