本文關(guān)鍵詞：人β防御素的改構(gòu)及活性研究

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【摘要】：目的：以人β防御素（hBDs）為基礎(chǔ)，通過改變特定氨基酸序列獲得原防御素的突變體，旨在提高其殺菌活力，同時降低鹽敏感性，并初步探討防御素的構(gòu)效關(guān)系與機(jī)理。摸索防御素的原核表達(dá)途徑。 方法：（1）Fmoc法合成防御素，對合成后的防御素進(jìn)行初步的純度分析以及結(jié)構(gòu)分析。（2）對合成的防御素進(jìn)行殺菌以及鹽敏感性的分析，并應(yīng)用透射電鏡觀察防御素的作用方式。（3）用MTT法對合成防御素進(jìn)行細(xì)胞毒性分析，，同時通過溶血實驗來分析其對血細(xì)胞的毒性。（4）將hBD-3進(jìn)行原核表達(dá)純化。 結(jié)果：（1）在人β防御素1-4（hBD-1-4）中，hBD-3對測試菌有最強(qiáng)的殺菌活力及最強(qiáng)的耐鹽活力，對測試菌株的百分之九十殺死率（LD90）在15μg/ml以下。同時，合成的hBD-1抑菌活力很低，LD90超過100μg/ml。合成的hBD-2,4抑菌活力弱于hBD-3（P＜0.01），但并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的對革蘭氏陰陽菌的選擇性。（2）hBD-3的N端缺失突變體當(dāng)失去前9個氨基酸時活性及耐鹽能力顯著下降（P＜0.01），而失去前3個氨基酸的突變體耐鹽能力顯著提高（P＜0.01）。（3）經(jīng)過I區(qū)替換的改構(gòu)防御素都有著比hBD-3更強(qiáng)的殺菌活力及耐鹽能力，而它們各自的N端缺失突變體殺菌活性及耐鹽能力降低。（4）改構(gòu)體在耐鹽能力提高的同時，它們的細(xì)胞毒性以及溶血毒性也相應(yīng)提高。（5）電鏡結(jié)果顯示，防御素作用于細(xì)菌后，破壞細(xì)胞壁的同時造成質(zhì)壁分離，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。（6）成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體表達(dá)出融合蛋白GST-hBD-3。 結(jié)論：（1）在hBD1-4中，hBD-3的活性，耐鹽能力在所測試的菌株中最強(qiáng)，可以將它作為改構(gòu)的模板。（2）hBD-3的N端區(qū)域?qū)Ψ烙氐柠}敏感性有著重要作用。（3）hBD-3的I區(qū)對防御素殺菌活力有著重要影響。而對于防御素殺菌活性與細(xì)胞毒性的關(guān)系，需要在后期實驗中進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R394

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本文編號：1237522