本文關(guān)鍵詞：臨床分離銅綠假單胞菌株的臨床分布特征及Quorum Sensing系統(tǒng)編碼基因的研究

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【摘要】：銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginoisa, PA)為條件致病菌,也是引起醫(yī)院內(nèi)感染的主要致病菌之一。由于其極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力而分布廣泛。PA主要侵襲免疫力低下或免疫功能受到抑制的患者,進(jìn)而導(dǎo)致呼吸道感染、血液感染和尿路感染。近些年來隨著抗菌藥物的亂用、濫用使得抗菌藥物的耐藥率只升不降,再加上臨床治療中各種侵入性操作的增加,更是使得銅綠假單胞菌的耐藥率上升情況雪上加霜,甚至出現(xiàn)多藥耐藥,給臨床抗菌治療帶來許多困難。銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制復(fù)雜,其中之一就是細(xì)菌生物膜的形成。 目前,生物被膜研究成為當(dāng)前的研究熱點,大量文獻(xiàn)顯示,生物被膜是細(xì)菌形成感染的必備條件。密度感應(yīng)(Quorum Sensing,QS)系統(tǒng)與生物膜的分化和成熟之間的關(guān)系非常親密。銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)的缺失對細(xì)菌生物膜是否有影響?從分子生物學(xué)的角度來說是如何影響?本課題通過對銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)缺陷株QS編碼基因進(jìn)行檢測,探討QS系統(tǒng)調(diào)控機(jī)制。試圖從基因?qū)用�、配體分子層面等分子生物學(xué)方面對QS系統(tǒng)進(jìn)行干擾,為臨床抗感染尋求新的途徑。 1、臨床分離銅綠假單胞菌的多藥耐藥情況及臨床分布特征 目的：從臨床的角度出發(fā),對某院臨床分離銅綠假單胞菌主要標(biāo)本類型及易感染科室的規(guī)律有個初步的了解,并檢測PA的多藥耐藥情況。 方法：連續(xù)收集某院住院及門診患者的痰、咽拭子、分泌物及血液等臨床標(biāo)本。所有菌株均經(jīng)生物梅里埃公司VITEK-2重新鑒定；采用瓊脂倍比稀釋法測定菌株的MIC值,依據(jù)2012年版美國實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)推薦的銅綠假單胞菌對常用抗菌藥物的MIC值判定耐藥性；將同時對≥3種抗菌藥物耐藥的菌株判定為多藥耐藥菌株；用WHONET5.5版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析標(biāo)本臨床分布特征。 結(jié)果：(1)66株銅綠假單胞菌標(biāo)本中檢出率最高的是痰液64.94%(43/66),其次為分泌物14.29%(9/66),無菌體液中尿占到7.79%(5/66)、血液占到6.49%(4/66)、腹水占到1.3%(1/66)。(2)在臨床科室中檢出率居首位的是ICU和呼吸科,均為15.15%(10/66),居第二和第三的分別是血液科12.12%(8/66)和神經(jīng)科、骨科9.09(6/66),風(fēng)濕科、消化科、腎內(nèi)科和普外科很相近,均在5%左右；(3)在MIC值得測定中,耐藥率最高的抗菌藥物為氨曲南(45.45%),其次為頭孢哌酮/舒巴坦(39.39%),耐藥率最低的為哌拉西林/他唑巴坦(9.1%),多藥耐藥菌株占到27.27%(18/66)。其中同時對丁胺卡那、美羅培南和氨曲南耐藥的有9株,占到多藥耐藥菌株的50%；同時對左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、氨曲南耐藥的有6株,占到多藥耐藥菌株的33.3%；同時對哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南耐藥的有5株,占到多藥耐藥的菌株的27.8%。 2.、臨床分離銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)缺陷株的篩選及生物被膜形成能力的分析 目的：探討銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)是否影響生物膜的形成。 方法：依據(jù)銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的產(chǎn)生嚴(yán)格依賴QS系統(tǒng),彈性蛋白酶缺失的則為QS系統(tǒng)缺陷株。利用平板結(jié)合結(jié)晶紫染色法建立PA生物膜,并定量分析臨床分離的銅綠假單胞菌生物被膜形成能力。 結(jié)果：66株菌中檢測出有6株(27號、33號、38號、42號、62號、66號)QS缺陷株,檢出率為9.09%(6/66),QS系統(tǒng)非缺陷株高達(dá)90.91%。缺陷株A570平均值=0.434,非缺陷株A570平均值=1.113,在非缺陷菌株中Amax=2.285, Amin=0.679。 3、臨床分離銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)編碼基因分析 目的：從分子生物學(xué)出發(fā),探索銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)的編碼基因是否存在異常,為臨床治療銅綠假單胞菌的感染尋求新的途徑。 方法：用由寶生物(大連)有限公司提供的DNA提取試劑盒提取出銅綠假單胞菌染色體DNA,利用PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖電泳實驗初步判斷銅綠假單胞菌QS缺陷株所缺的基因,然后進(jìn)行DNA序列檢測,用Bioedit軟件將分離銅綠假單胞菌QS缺陷株與野生株P(guān)AO1的基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對并轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)的氨基酸序列與野生株P(guān)AO1進(jìn)行比對。 結(jié)果：①電泳結(jié)果顯示：27號菌株的rhlR、lasI基因缺失；42號菌株的lasI、 lasR、rhlI、rhlR四個基因均缺失；33、38、62、66號菌株的lasR基因均缺失。②基因比對和蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對結(jié)果顯示：27號、33號、38號菌株的rhlR基因序列多個位點發(fā)生堿基替換突變,其中第402位、第597位的堿基突變使得編碼蛋白氨基酸序列第130個、第195個氨基酸由異亮氨酸、苯丙氨酸分別變?yōu)樘K氨酸、絲氨酸,此外38號菌株的rhlR基因序列在第696位發(fā)生堿基缺失(移碼)突變、697位發(fā)生堿基替換突變使得第113個氨基酸由絡(luò)氨酸變?yōu)榻z氨酸。33號、38號菌株的rh1I基因發(fā)生多位點突變,其中第118位堿基替換突變使得第35個氨基酸由纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼?62號和66號菌株的rh1I基因序列發(fā)生多位點突變,其中第85位、第266位堿基替換突變使得第24個、第88個氨基酸由精氨酸、蛋氨酸分別變?yōu)榘腚装彼�、亮氨酸�?結(jié)論： 1、人體呼吸道最容易受到銅綠假單胞菌的侵襲,ICU和呼吸科的患者是銅綠假單胞菌感染的高危人群,是重點監(jiān)控的對象。對銅綠假單胞菌最敏感的為哌拉西林/他唑巴坦,同時,銅綠假單胞菌的多藥耐藥多見于丁胺卡那、美羅培南、氨曲南、頭孢哌酮/舒巴坦的使用,選擇藥物時,應(yīng)避免重復(fù)。 2、銅綠假單胞菌臨床分離株大部分是QS系統(tǒng)功能正常菌株,具有生物膜形成能力。 3、銅綠假單胞菌QS缺陷株的生物膜形成能力明顯降低。 4、銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)編碼基因存在高突變區(qū),基因突變導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列發(fā)生改變。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378.991

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