本文關(guān)鍵詞：小鼠無纖毛柱狀上皮細(xì)胞分泌蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其生物活性的鑒定

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【摘要】：目的克隆小鼠無纖毛柱狀上皮細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)基因并構(gòu)建其真核表達(dá)重組體,鑒定重組CCSP的生物學(xué)活性。方法采用TRIzol法提取小鼠肺組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對CCSP基因進(jìn)行擴(kuò)增,Bam H I和XhoⅠ雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物與真核表達(dá)載體p CDNA3.1(+),酶切產(chǎn)物連接并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞Trans 5α,陽性重組質(zhì)粒p CDNA3.1(+)-m CCSP經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定正確后,通過DNAfectin 2100 DNA轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎(HEK293T)細(xì)胞,采用Western blot法檢測表達(dá)產(chǎn)物。脂多糖分別刺激轉(zhuǎn)染有p CDNA3.1(+)-m CCSP和p CDNA3.1(+)質(zhì)粒DNA的HEK 293T細(xì)胞,利用磷脂酶A2的水解作用,以摻入大腸桿菌膜的[3H]標(biāo)記的油酸為酶解底物,檢測HEK 293T細(xì)胞內(nèi)PLA2的活力。結(jié)果聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示,從小鼠肺組織中擴(kuò)增出約290 bp的片段。菌落PCR、雙酶切及測序結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒p CDNA3.1(+)-m CCSP構(gòu)建成功且序列正確。Western blot結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染p CDNA3.1(+)-m CCSP的HEK293T細(xì)胞中有CCSP蛋白的表達(dá),蛋白質(zhì)分子量約為10 k Da,而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組未見表達(dá)。CCSP蛋白可以顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的HEK 293T細(xì)胞內(nèi)PLA2的活力。結(jié)論成功構(gòu)建了真核表達(dá)重組體p CDNA3.1(+)-m CCSP,且重組蛋白CCSP具有生物學(xué)活性,為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸科;山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81200032) 山西省研究生優(yōu)秀創(chuàng)新項(xiàng)目(20123063) 山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(2015-101) 山西省留學(xué)回國人員科技活動項(xiàng)目擇優(yōu)資助(2015)
【分類號】：R3411
【正文快照】： 無纖毛柱狀上皮細(xì)胞分泌蛋白(Clara cellsecretory protein,CCSP)主要由細(xì)支氣管、終末細(xì)支氣管黏膜上的Clara細(xì)胞分泌產(chǎn)生,分子量為15.8 k Da,因此也稱作CC16。CCSP主要在肺組織表達(dá)[1],而作為一種內(nèi)源的抗炎物質(zhì),其在肺內(nèi)有很重要的抗炎作用[2],抑制磷酯酶A2(phospholipase

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