本文關(guān)鍵詞：小鼠無(wú)纖毛柱狀上皮細(xì)胞分泌蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其生物活性的鑒定

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【摘要】：目的克隆小鼠無(wú)纖毛柱狀上皮細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)基因并構(gòu)建其真核表達(dá)重組體,鑒定重組CCSP的生物學(xué)活性。方法采用TRIzol法提取小鼠肺組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)CCSP基因進(jìn)行擴(kuò)增,Bam H I和XhoⅠ雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物與真核表達(dá)載體p CDNA3.1(+),酶切產(chǎn)物連接并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞Trans 5α,陽(yáng)性重組質(zhì)粒p CDNA3.1(+)-m CCSP經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定正確后,通過(guò)DNAfectin 2100 DNA轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎(HEK293T)細(xì)胞,采用Western blot法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。脂多糖分別刺激轉(zhuǎn)染有p CDNA3.1(+)-m CCSP和p CDNA3.1(+)質(zhì)粒DNA的HEK 293T細(xì)胞,利用磷脂酶A2的水解作用,以摻入大腸桿菌膜的[3H]標(biāo)記的油酸為酶解底物,檢測(cè)HEK 293T細(xì)胞內(nèi)PLA2的活力。結(jié)果聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示,從小鼠肺組織中擴(kuò)增出約290 bp的片段。菌落PCR、雙酶切及測(cè)序結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒p CDNA3.1(+)-m CCSP構(gòu)建成功且序列正確。Western blot結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染p CDNA3.1(+)-m CCSP的HEK293T細(xì)胞中有CCSP蛋白的表達(dá),蛋白質(zhì)分子量約為10 k Da,而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組未見(jiàn)表達(dá)。CCSP蛋白可以顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的HEK 293T細(xì)胞內(nèi)PLA2的活力。結(jié)論成功構(gòu)建了真核表達(dá)重組體p CDNA3.1(+)-m CCSP,且重組蛋白CCSP具有生物學(xué)活性,為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸科;山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(81200032) 山西省研究生優(yōu)秀創(chuàng)新項(xiàng)目(20123063) 山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(2015-101) 山西省留學(xué)回國(guó)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目擇優(yōu)資助(2015)
【分類號(hào)】：R3411
【正文快照】： 無(wú)纖毛柱狀上皮細(xì)胞分泌蛋白(Clara cellsecretory protein,CCSP)主要由細(xì)支氣管、終末細(xì)支氣管黏膜上的Clara細(xì)胞分泌產(chǎn)生,分子量為15.8 k Da,因此也稱作CC16。CCSP主要在肺組織表達(dá)[1],而作為一種內(nèi)源的抗炎物質(zhì),其在肺內(nèi)有很重要的抗炎作用[2],抑制磷酯酶A2(phospholipase

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1 牛嗣云;岳鳳鳴;陳志宏;高維娟;高福祿;;人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];解剖學(xué)雜志;2008年05期

2 彭武建,戴勇,李體遠(yuǎn),杜珙,孫文學(xué),陳德珩,徐卓佳;人組織激肽釋放酶基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J];廣東醫(yī)學(xué);2003年12期

3 王福祥,孫永濤,李光玉;人白細(xì)胞介素-18真核表達(dá)載體的構(gòu)建及測(cè)序分析[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2004年02期

4 劉娟,孫永濤,杜德偉,李光玉,劉秋平,翟嵩;人中性粒細(xì)胞多肽1,3真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2004年10期

5 陳昌杰,趙莉;人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定[J];中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志;2004年06期

6 徐卓佳,戴勇,李體遠(yuǎn),彭武建;重組人促紅細(xì)胞生成素四環(huán)素調(diào)控真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J];中國(guó)醫(yī)師雜志;2005年09期

7 何煒,張朝,章茜,趙國(guó)強(qiáng),董子明;真核表達(dá)載體pcDNA3.1-MAGE-1的構(gòu)建[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年04期

8 趙杰;張瑞;許予明;趙國(guó)強(qiáng);郭建新;宋波;韓志強(qiáng);;真核表達(dá)載體pEGFP-C_3-MASH-1的構(gòu)建[J];醫(yī)藥論壇雜志;2006年08期

9 任淑婷;于琳華;徐長(zhǎng)福;高廣道;;四環(huán)素誘導(dǎo)性人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2006年10期

10 彭仕芳;傅蕾;譚德明;侯周華;;人可溶性腫瘤壞死因子受體1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)工程;2007年03期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周儀華;王耀晟;何力鵬;鮑曉明;黃曉;程曉曙;;可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1真核表達(dá)載體pEGFP-N1/sflt-1的構(gòu)建及在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)急診醫(yī)學(xué)分會(huì)第十三次全國(guó)急診醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)大會(huì)論文集[C];2010年

2 王懷鵬;蒲小勇;王行環(huán);單志新;高煒城;楊中華;李世林;羅耀雄;徐戰(zhàn)平;;巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定[A];第十五屆全國(guó)泌尿外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

3 邱明鏈;;真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-hFasL的構(gòu)建及鑒定[A];2012中國(guó)器官移植大會(huì)論文匯編[C];2012年

4 程蓓;葉大風(fēng);謝幸;陳懷增;呂衛(wèi)國(guó);;人白細(xì)胞介素7基因克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建[A];2000全國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2000年

5 吳涓涓;章曉聯(lián);;反義葡萄糖苷酶Ⅰ和分子伴侶鈣聯(lián)蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建[A];湖北省暨武漢市免疫學(xué)會(huì)第八屆學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2003年

6 承海;糜漫天;張乾勇;;ω-3脂肪酸依賴的跨膜型TNFα真核表達(dá)載體的構(gòu)建及抗癌效應(yīng)研究[A];中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2004年

7 田曉濱;孫立;楊述華;;克隆并構(gòu)建人骨形成蛋白-2真核表達(dá)載體[A];2006年貴州省醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2006年

8 張燦;鞠吉雨;馮永堂;李在連;;乙肝病毒反義X基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建[A];山東免疫學(xué)會(huì)、山東微生物學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)、山東省醫(yī)學(xué)會(huì)微生物學(xué)和免疫學(xué)專業(yè)委員會(huì)、山東省醫(yī)藥生物技術(shù)學(xué)會(huì)2001年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2001年

9 林英;鄭建秋;劉平;葛紅巖;侯麗麗;呂鋒;金迪;馬洪梅;付曉玻;;縫隙連接蛋白50真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)眼科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2007年

10 李剛;王平;;人膀胱逼尿肌中腎上腺素能β_2受體基因的克隆及反義真核表達(dá)載體的構(gòu)建[A];全面建設(shè)小康社會(huì)：中國(guó)科技工作者的歷史責(zé)任——中國(guó)科協(xié)2003年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下）[C];2003年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 張中橋;可誘導(dǎo)性真核表達(dá)載體構(gòu)建成功[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2004年

2 ;1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 張守純;p16真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)基因的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2004年

2 王小芳;重組腎上腺髓質(zhì)素真核表達(dá)載體的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

3 張?jiān)?SLC34A2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染人肺泡上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2008年

4 杜德偉;丙型肝炎病毒的受體研究——B族Ⅰ型清道夫受體介導(dǎo)HCV入胞作用的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 廖新華;Neuritin轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建與鑒定[D];石河子大學(xué);2015年

2 辛莉;CRMP-1-phrGFP II-N真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)突起生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)[D];暨南大學(xué);2007年

3 呂婷婷;pHsa-miR16-shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建、體外轉(zhuǎn)錄及其活性的鑒定[D];華中科技大學(xué);2009年

4 王艷芳;慢性粒細(xì)胞白血病bcr/abl cDNA克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建[D];山西醫(yī)科大學(xué);2006年

5 張志武;CD80-pIRES-SART3真核表達(dá)載體的構(gòu)建[D];華中科技大學(xué);2011年

6 王圓圓;CRMP-5-pEGFP-C2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及促神經(jīng)元突起生長(zhǎng)作用[D];暨南大學(xué);2009年

7 周夢(mèng)云;組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-4真核表達(dá)載體的構(gòu)建和功能研究[D];蘇州大學(xué);2007年

8 朱曉西;pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)7402肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2011年

9 盧春生;人骨形成蛋白2和7成熟肽編碼區(qū)基因克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2009年

10 李剛;人膀胱逼尿肌中腎上腺素能β_2受體基因的克隆及反義真核表達(dá)載體的構(gòu)建[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2003年

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