本文關(guān)鍵詞：識(shí)別子孢子TLRs的鑒定及其抑制瘧原蟲肝期發(fā)育機(jī)制的研究

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【摘要】：Toll樣受體(TLRs)是固有免疫系統(tǒng)中非常重要的一類模式識(shí)別受體(PRRs),它們通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)模式分子(PAMPs)啟動(dòng)固有免疫從而抵抗外界病原體入侵。因此，天然免疫識(shí)別病原體成分成為宿主對(duì)病原體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的第一步。迄今為止，在對(duì)瘧原蟲天然免疫識(shí)別的研究中，鑒定出TLR2、TLR4以及TLR9參與了宿主固有免疫對(duì)瘧原蟲紅內(nèi)期的識(shí)別，而對(duì)于其他TLRs是否參與識(shí)別紅內(nèi)期成分仍不清楚。更重要的是由于受到高純度子孢子分離純化的技術(shù)限制，對(duì)TLR受體是否參與天然免疫系統(tǒng)識(shí)別瘧原蟲子孢子未見報(bào)道。本研究利用過(guò)DE52柱的方式分離獲得了高純度的子孢子，通過(guò)建立檢測(cè)NF-κB及IFN-β報(bào)告基因活化的雙熒光素酶平臺(tái)和蚊叮咬小鼠的瘧疾感染平臺(tái)和改進(jìn)子孢子分離純化方法，發(fā)現(xiàn)TLR2能夠識(shí)別子孢子成分，并對(duì)其在瘧原蟲肝期生長(zhǎng)發(fā)育中的作用和機(jī)制進(jìn)行了初步研究。 一、利用雙熒光素酶平臺(tái)篩選可以識(shí)別瘧原蟲成分的TLR： 1、檢測(cè)TLRs活化雙熒光素酶平臺(tái)的建立:構(gòu)建小鼠重組TLR1，TLR3，TLR4，MD-2，TLR5，TLR6，TLR7，TLR9真核表達(dá)質(zhì)粒，與NF-κB和IFN-β報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染293FT，建立了檢測(cè)TLR活化的雙熒光素酶平臺(tái)。 2、識(shí)別子孢子TLRs的鑒定：利用解剖過(guò)柱的方法分離純化約氏瘧原蟲BY265株子孢子，反復(fù)凍融制備了裂解產(chǎn)物，經(jīng)檢測(cè)子孢子裂解產(chǎn)物內(nèi)毒素含量?jī)H為11EU/ml；對(duì)感染小鼠心臟取血，經(jīng)超聲制備了裂解產(chǎn)物。利用雙熒光素酶平臺(tái)對(duì)裂解產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR2、TLR2/1、TLR2/6、TLR4以及TLR9可被約氏瘧原蟲17XL株紅內(nèi)期成分所活化，說(shuō)明成功建立了雙熒光素酶平臺(tái)；而約氏瘧原蟲BY265紅外期子孢子反復(fù)凍融產(chǎn)物僅以通過(guò)TLR2、TLR2/1及TLR2/6而不是其他TLR受體活化NF-κB(P0.05)。 3、約氏瘧原蟲子孢子以TLR2依賴的方式刺激腹腔巨噬細(xì)胞分泌促炎癥因子：分離WT，TLR2-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用制備好的約氏瘧原蟲子孢子裂解產(chǎn)物進(jìn)行刺激，22-24h后，使用CBA Mouse Inflammation Kit檢測(cè)培養(yǎng)上清細(xì)胞因子含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子孢子依賴于TLR2信號(hào)通路促使巨噬細(xì)胞分泌IL-6、MCP-1和TNF-(P0.05)。 二、TLR2抑制肝期瘧原蟲發(fā)育及其機(jī)制研究： 1、約氏子孢子感染后，TLR2缺失導(dǎo)致肝期蟲荷和原蟲血癥的增加：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在尾靜脈注射子孢子及蚊叮咬感染實(shí)驗(yàn)中，TLR2和Myd88缺失小鼠的肝臟蟲荷明顯高于WT小鼠(P0.05)。而由于受到肝期蟲荷的影響，TLR2缺失小鼠的原蟲血癥和死亡率都明顯高于WT小鼠(P0.05)。 2、活化TLR2能夠抑制約氏瘧原蟲肝期的生長(zhǎng)發(fā)育：為了驗(yàn)證TLR2信號(hào)通路的作用，本研究將20μg TLR2激動(dòng)劑LTA-BS、Pam3CSK4及FSL-1分別和子孢子一起經(jīng)尾靜脈注射至WT小鼠體內(nèi)，隨后觀察小鼠肝臟蟲荷發(fā)現(xiàn)，注射激動(dòng)劑組小鼠肝臟蟲荷相比未注射組都有不同程度的降低(P0.05)。表明活化TLR2信號(hào)通路能夠抑制肝臟瘧原蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，降低蟲荷。 3、約氏子孢子感染后，TLR2缺失導(dǎo)致肝臟促炎癥因子的下調(diào)：對(duì)小鼠肝臟的促炎癥因子mRNA水平進(jìn)行染料q-PCR檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)無(wú)論采用尾靜脈注射子孢子或是蚊叮咬方式感染，感染后的TLR2缺失小鼠比的感染后的WT小鼠，其肝臟中IL-6、TNF-、IFN-γ、IL-12p40和IL-10mRNA水平都有不同程度的下調(diào)(P0.05)。 4、TLR2的缺失同樣促進(jìn)伯氏瘧原蟲肝期的生長(zhǎng)發(fā)育：為了探究TLR2信號(hào)通路在其他瘧原蟲種屬感染中的作用，本研究采用自然叮咬感染的方式，使感染伯氏瘧原蟲ANKA株17天的雌性按蚊叮咬WT和TLR2缺失小鼠，42小時(shí)后，定量檢測(cè)其肝臟蟲荷，發(fā)現(xiàn)TLR2缺失小鼠肝臟蟲荷及死亡率均高于WT小鼠(P0.05)。 本研究通過(guò)建立雙熒光素酶平臺(tái)的篩選，首次發(fā)現(xiàn)了瘧原蟲子孢子可以通過(guò)TLR2活化NF-κB，而TLR2缺失之后的小鼠抵御肝期瘧原蟲感染能力明顯下降，其原因可能與TLR2缺失后子孢子無(wú)法通過(guò)該受體信號(hào)通路促進(jìn)炎癥因子的分泌，，從而導(dǎo)致蟲荷增加，原蟲血癥及死亡率也相對(duì)增高相關(guān)。說(shuō)明子孢子在入侵過(guò)程中活化TLR2對(duì)于小鼠抑制肝期瘧原蟲生長(zhǎng)發(fā)育中是極其重要的。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R382.31

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本文編號(hào)：1207661