本文關(guān)鍵詞：新型丙型肝炎病毒Core及NS3抗原的制備

  更多相關(guān)文章： 丙型肝炎病毒 慢病毒 真核表達(dá) NS3 Core 純化 應(yīng)用

【摘要】：HCV是一種非甲非乙型肝炎病毒,后命名為丙型肝炎病毒,歸屬于肝病毒屬(Hepacivirus),黃病毒科(Flaviviridae)。 丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染引起的病毒性肝炎,主要通過(guò)輸血、針刺、吸毒等血液途徑傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),目前全世界范圍內(nèi),大約有1.8億人感染了丙型肝炎病毒,僅中國(guó)就有大約4千萬(wàn)名HCV感染者,感染率約為3.2%,是HCV感染的高流行區(qū)。丙型肝炎病毒感染者中55%～85%發(fā)展成為慢性肝炎,其中5～25%進(jìn)一步發(fā)展為諸如肝硬化等復(fù)合慢性肝病,并且每年又有約1～4%的人發(fā)展為肝癌(HCC),研究揭示78%原發(fā)性肝癌由HCV慢性感染導(dǎo)致。 HCV病毒基因組序列具有高度的多態(tài)性,主要可分為11種不同的基因型,70多種亞型。我國(guó)感染HCV主要以1b和2a型常見(jiàn),特別是1b型,約占整人群的70%。且1b型HCV完整結(jié)構(gòu)蛋白基因序列與現(xiàn)有基因型1a、1b、2a、2b、3、4、5和6型丙型肝炎病毒之間的核苷酸序列同源性為69.1%。 HCV病毒體呈球形,為單股正鏈RNA病毒。HCV-RNA全長(zhǎng)約為9.6kb,其基因組由結(jié)構(gòu)(核心,囊膜)和非結(jié)構(gòu)(蛋白酶,螺旋酶,酶輔助因子)蛋白及非編碼區(qū)組成。位于基因中央的開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼3000多氨基酸的前體多聚蛋白,其通過(guò)宿主和病毒的蛋白酶作用被切割成10個(gè)具有獨(dú)立功能的HCV蛋白,根據(jù)功能的不同分別命名為核心蛋白Core(C),包膜蛋白1、2(E1、E2),p7和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。 其中HCV核心區(qū)是HCV進(jìn)行基因和血清分型的靶基因區(qū),也是從基因水平上治療HCV感染和進(jìn)行疫苗研究的重要區(qū)域,而且核心區(qū)基因最為保守,其編碼的抗原免疫性最強(qiáng)。丙型肝炎病非結(jié)構(gòu)蛋白NS3(1192-1457aa)具有絲氨酸蛋白酶、解旋酶和NTP酶活性,是HCV病毒復(fù)制中重要的功能蛋白之一。NS3蛋白C末端2/3氨基酸構(gòu)成HCV NS3解旋酶(helicase),發(fā)揮三磷酸腺苷酶(ATPase)和解旋酶作用,使雙鏈RNA解旋,對(duì)HCVRNA復(fù)制起到重要作用。同時(shí),NS3解旋酶含有大量B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位,能在HCV感染早期誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生體液免疫反應(yīng),產(chǎn)生抗體。Core和NS3抗原相應(yīng)的抗體出現(xiàn)早、分布廣、親和力強(qiáng),因此Core和NS3蛋白已成為當(dāng)今血液篩查診斷試劑的主要原料。 目前對(duì)丙型肝炎病毒感染者的篩查仍缺乏十分有效的快速診斷試劑。我國(guó)獻(xiàn)血者HCV感染篩查使用的兩遍Elisa檢測(cè)方法符合率僅在50%左右,假陽(yáng)性率高達(dá)30%,對(duì)獻(xiàn)血者隊(duì)伍造成極大損害。當(dāng)前檢查方法使用的抗原為重組大腸桿菌表達(dá)的Core、NS3、NS4和NS5等抗原,存在反應(yīng)性弱、非特性強(qiáng)等不足,嚴(yán)重影響了HCV抗體檢測(cè)的準(zhǔn)確性。利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HCV抗原,其加工修飾過(guò)程更利于氨基酸鏈折疊為天然構(gòu)象的蛋白,具有更高的特異性。且真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白有更低的免疫原性,可降低原核表達(dá)系統(tǒng)帶來(lái)的非特異性。Huh7.5.1細(xì)胞系來(lái)源于人肝癌細(xì)胞系,是用于體外HCV相關(guān)研究的主要細(xì)胞系,相比于其他組織細(xì)胞更易于表達(dá)HCV相關(guān)蛋白,且加工折疊后的蛋白更接近天然蛋白的構(gòu)象與活性,可用于HCV Core和NS3蛋白的大量表達(dá)。 慢病毒(Lentivirus,LV)為一類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒的亞群。由HIV-1改建而來(lái)的慢病毒載體系統(tǒng)以其高效而穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移效率而成為近年來(lái)研究者們的主要選擇。由于LV既能感染處于分裂期的細(xì)胞,又能感染處于非分裂期的細(xì)胞,而且由LV攜帶整合入宿主基因組的目的基因?qū)D(zhuǎn)錄沉默作用有較強(qiáng)的抵抗力,使得目的基因可在宿主細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期而穩(wěn)定表達(dá)。同時(shí),慢病毒感染目的細(xì)胞的過(guò)程與天然HCV病毒感染細(xì)胞的過(guò)程比較相似,但慢病毒無(wú)法自我復(fù)制,具有較高的生物安全性。綜上所述,與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比,LV具有較高的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,蛋白表達(dá)具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性及較高的生物安全性。因此,以攜帶重組HCVCore和NS3基因的慢病毒載體為表達(dá)載體,包裝為重組慢病毒后感染目的細(xì)胞促使其大量表達(dá)Core及NS3抗原的方法具有重大優(yōu)勢(shì)與意義。 我們通過(guò)從含有1b型HCV Core全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒SQT7DH-5和含有NS3全長(zhǎng)基因的pMD20NS2-4A質(zhì)粒中分別擴(kuò)增Core和NS3目的基因,同時(shí)通過(guò)引物設(shè)計(jì)分別在Core蛋白和NS3蛋白的N端引入分泌型親水信號(hào)肽SP(MWTLVSWVALTAGLVAG),C端添加6His標(biāo)簽。即從N末端至C末端為SP-Core/NS3-6His,并將目的序列插入慢病毒載體pHAGE-fullEF1α-MCS-IZsGreen,構(gòu)建為表達(dá)載體pHAGE-fullEF1α-Core-MCS-IZsGreen和pHAGE-fullEF1α-NS3-MCS-IZsGreen。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式將構(gòu)建好的慢病毒載體與病毒包裝輔助質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2按一定比例轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過(guò)293T細(xì)胞包裝成具有感染活性的攜帶有HCV Core和NS3基因的重組慢病毒LV-Core和LV-NS3。將一定量的LV-Core和LV-NS3感染人肝癌細(xì)胞系Hun7.5.1細(xì)胞,其RNA能逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并與目的細(xì)胞的基因組相整合,從而特異性地促進(jìn)Huh7.5.1細(xì)胞大量表達(dá)HCV Core和NS3抗原。Huh7.5.1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的可溶性NS3蛋白由于帶有6His的組氨酸標(biāo)簽,可將細(xì)胞裂解后通過(guò)Ni-NTA和CNBr-4B偶聯(lián)特異性抗體柱親和層析純化。Core蛋白是強(qiáng)堿性蛋白,可通過(guò)陽(yáng)離子交換的方法純化,獲得一定純度的NS3和Core蛋白。 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)方法,用分子克隆常規(guī)方法構(gòu)建并鑒定了正確的含有目的蛋白基因的表達(dá)載體pHAGE-fullEF1α-Core-MCS-IZsGreen和pHAGE-fullEF1α-NS3-MCS-IZsGreen,并通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T的方法初步鑒定了這兩個(gè)質(zhì)粒能在真核細(xì)胞中正確表達(dá)目的蛋白和標(biāo)簽蛋白,目的蛋白存在于細(xì)胞內(nèi)。通過(guò)共轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和第三代慢病毒包裝系統(tǒng)的另兩個(gè)輔助質(zhì)粒至293T,分別包裝得到了基因拷貝數(shù)為2.3×109copies/ml的LV-Core病毒上清和基因拷貝數(shù)為3.3×108copies/ml的LV-NS3病毒上清。將一定量的重組慢病毒分別感染Huh7.5.1、CHO和293A細(xì)胞后通過(guò)觀察綠色熒光標(biāo)簽蛋白和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)Huh7.5.1相比于293A細(xì)胞更容易被重組慢病毒所感染。免疫熒光檢測(cè)和WesternBlot分析顯示,重組HCV Core和NS3蛋白都主要分布于胞漿內(nèi)。通過(guò)裂解細(xì)胞,將裂解上清和細(xì)胞碎片沉淀分別做Western Blot,發(fā)現(xiàn)Core和NS3蛋白都是部分可溶,并且NS3的親水性要高于Core。由于通過(guò)慢病毒整合到Huh7.5.1細(xì)胞中的Core和NS3基因能持續(xù)表達(dá),將感染了重組慢病毒并鑒定能正確表達(dá)目的蛋白的Huh7.5.1大量培養(yǎng)后收集細(xì)胞,破碎后取上清。利用NS3蛋白C端的6his標(biāo)簽蛋白與金屬離子Ni2+的親和性,用親和層析的方法初步純化從細(xì)胞中裂解出來(lái)的可溶性NS3蛋白,再用偶聯(lián)了NS3特異性單克隆抗體的CNBr4B填料進(jìn)一步純化NS3,得到純度約為80%的純化后NS3蛋白。 本課題采用相近于HCV復(fù)制的新型慢病毒介導(dǎo)的真核表達(dá)系統(tǒng),兼具慢病毒表達(dá)載體和真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn),制備Core和NS3抗原,建立大規(guī)模生產(chǎn)與純化工藝,為獻(xiàn)血者HCV感染篩查或臨床診斷提供新一代免疫測(cè)定新型抗原。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 杜勇,劉育京,王海濤;丙型肝炎病毒核心蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)與純化[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;1998年05期

2 林潮雙,韋嘉,盧建溪,彭暉,高志良;定量RCR與EIA法檢測(cè)血液透析患者HCV比較[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2001年01期

3 ;丙型肝炎防治指南[J];中華肝臟病雜志;2004年04期

，

本文編號(hào)：1207086