本文關(guān)鍵詞：弓形蟲pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4基因疫苗的構(gòu)建及動物免疫保護(hù)性的研究

  更多相關(guān)文章： 弓形蟲 SAG1 SAG4 pVAX1 克隆和表達(dá) 免疫保護(hù)性

【摘要】：目的應(yīng)用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增弓形蟲表面抗原SAG1和SAG4目的基因片段，構(gòu)建pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4基因疫苗，分別及混合免疫小鼠后以動物的血清抗體和對弓形蟲感染的保護(hù)性為指標(biāo)，評價(jià)疫苗的免疫效果，為弓形蟲病DNA疫苗應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法提取弓形蟲RH株的基因組DNA，根據(jù)GenBank中弓形蟲RH標(biāo)準(zhǔn)株的SAG1和SAG4基因序列分別各設(shè)計(jì)一對特異性引物，通過PCR體外擴(kuò)增的方法獲取目的基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、測序和BLAST同源比對分析鑒定。經(jīng)鑒定的SAG1和SAG4基因片段回收純化后連接至PEGM-T Easy載體中構(gòu)建克隆重組質(zhì)粒PEGM-T Easy-SAG1和PEGM-T Easy-SAG4，克隆質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR、雙酶切和測序鑒定后，分別用限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ和BamHⅠ、XbaⅠ從PEGM-T Easy-SAG1和PEGM-T Easy-SAG4中切下SAG1和SAG4基因片段，亞克隆至質(zhì)粒pVAX1中，用菌落PCR、雙酶切進(jìn)行鑒定。鑒定后，大量提取重組質(zhì)粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4以制備基因疫苗。將制備的基因疫苗pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4分別及混合后經(jīng)后肢肌肉注入Bala/c小鼠3次，，每次間隔2W，小鼠斷尾取血，分離血清ELISA法測定弓形蟲抗體，末次免疫后2W用弓形蟲RH株速殖子攻擊，分別觀察小鼠的發(fā)病及死亡情況。 結(jié)果提取的基因組DNA用特異性引物進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增后獲得SAG1基因片段長772bp，SAG4基因片段長511bp，測序后經(jīng)BLAST同源性分析顯示獲得的兩個(gè)目的片段與弓形蟲RH標(biāo)準(zhǔn)株相對應(yīng)的SAG1基因和SAG4基因的cDNA同源性分別為99%和100%�？寺≈亟M質(zhì)粒PEGM-TEasy-SAG1和PEGM-T Easy-SAG4經(jīng)菌落PCR和雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示在800bp和500bp處有特異性條帶，測序結(jié)果也顯示SAG1和SAG4目的基因片段已正確地插入克隆質(zhì)粒T7啟動子下游，并含有HindⅢ、BamHⅠ和BamHⅠ、 XbaⅠ酶切位點(diǎn)。真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4經(jīng)菌落PCR和雙酶切鑒定后瓊脂糖凝膠電泳顯示分別在800bp和500bp處得到與預(yù)期大小一致的目的基因片段條帶SAG1和SAG4。核酸疫苗pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4單價(jià)及混合多價(jià)疫苗免疫小鼠后，各組的血清抗體OD值均為陰性。攻擊實(shí)驗(yàn)中混合多價(jià)疫苗比單價(jià)疫苗存活時(shí)間長，核酸單價(jià)疫苗pVAX1-SAG1比pVAX1-SAG4存活時(shí)間長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）。 結(jié)論用PCR方法成功從弓形蟲RH株速殖子基因中擴(kuò)增出SAG1和SAG4基因片段，構(gòu)建了克隆質(zhì)粒PEGM-T Easy-SAG1和PEGM-TEasy-SAG4及真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4。pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4重組質(zhì)粒能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生保護(hù)性免疫力，pVAX1-SAG1單價(jià)核酸疫苗的免疫保護(hù)保護(hù)性比pVAX1-SAG4好，而兩者混合組成的多價(jià)疫苗效果則比各自的單價(jià)疫苗更理想。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R382.5

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 丁潔瓊;吳q;譚峰;陳曉光;;弓形蟲速殖子與緩殖子體外轉(zhuǎn)化體系的建立[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年04期

2 羅師平,冷希崗;基于PCR的體外誘變技術(shù)[J];國外醫(yī)學(xué)(生物醫(yī)學(xué)工程分冊);2005年03期

3 楊雯;田春林;朱穗京;劉曉泉;;弓形蟲表面抗原SAG1基因的克隆表達(dá)、純化與鑒定[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年02期

4 陳海峰,鄭煥欽,徐勁,高世同,李華文,郭虹,周永安,陳觀今;SAG1和ROP1混合基因真核表達(dá)質(zhì)粒接種小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生拮抗致死性弓形蟲感染的保護(hù)性免疫[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2003年01期

5 曲云鵬;劉建國;楊德琴;麻健豐;陳代雄;柴巧學(xué);;變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶gtfB/CAT真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)[J];上�？谇会t(yī)學(xué);2008年03期

6 殷俊磊;周碧君;文明;樊翠華;楊穎;杜海燕;;以減毒沙門氏菌為載體山羊痘病毒P32基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J];生物技術(shù);2010年04期

7 呂婧;楊曉玲;王惠珍;張棟;牛勃;;乙型肝炎病毒X基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J];生物技術(shù)通訊;2010年03期

8 孟和寶力高;其其格;額爾敦;;DNA免疫的作用機(jī)制及影響因素[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2007年07期

9 周永安;余新炳;陳海峰;鄭煥欽;殷國榮;吳忠道;陳觀今;;脂質(zhì)體介導(dǎo)弓形蟲SAG1與SAG3復(fù)合基因誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2006年07期

10 蔣華,何深一,周懷瑜,叢華,古欽民,李瑛,趙群力;弓形蟲復(fù)合抗原基因P30-ROP2體外擴(kuò)增、克隆及真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建[J];中國寄生蟲病防治雜志;2005年01期

本文編號：1203082