本文關(guān)鍵詞：UCH-L3基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在雷帕霉素誘導(dǎo)的NCI-H460細(xì)胞自噬中的作用的研究

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【摘要】：目的：本研究通過構(gòu)建UCH-L3真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染NCI-H460細(xì)胞,并且加入雷帕霉素誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞自噬,分別檢測未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDN A3.1(+)-UCH-L3-EGFP組及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-EGFP組NCI-H460細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白和UCH-L3蛋白表達(dá)的改變,進(jìn)一步探討UCH-L3在雷帕霉素誘導(dǎo)的NCI-H460細(xì)胞自噬中的作用。 方法： 1.UCH-L3真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：培養(yǎng)NCI-H460細(xì)胞,運(yùn)用RT-PCR技術(shù)獲取人類UCH-L3基因片段,運(yùn)用雙酶切、基因克隆等技術(shù)將目的基因片段克隆入質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-EGFP,構(gòu)建pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒并采用雙酶切及測序方法進(jìn)行鑒定。 2.將實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP組及pcDNA3.1(+)-EGFP組,采用陽離子脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染NCI-H460細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后,于熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP表達(dá)陽性細(xì)胞所占的比例,評估轉(zhuǎn)染效率。重復(fù)以上轉(zhuǎn)染過程并于轉(zhuǎn)染24h后使用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測UCH-L3基因mRNA表達(dá)情況。 3.western blot方法檢測UCH-L3和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平：實(shí)驗(yàn)分為不加藥+未轉(zhuǎn)染組、不加藥+pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP組、不加藥+pcDNA3.1(+)-EGFP組、加藥+未轉(zhuǎn)染組、加藥+pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP組、加藥+pcDNA3.1(+)-EGFP組,按照分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染及雷帕霉素處理,收集各組細(xì)胞并提取總蛋白,采用western blot方法分別檢測各組中LC3-Ⅱ蛋白和UCH-L3蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.UCH-L3真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：經(jīng)雙酶切、基因測序等方法證實(shí)pcDN A3.1(+)-UCH-L3-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.轉(zhuǎn)染48h后,將6孔板置于倒置熒光顯微鏡下,可見有綠色熒光蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞,陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)約占總細(xì)胞數(shù)的50～60%。實(shí)時定量PCR方法檢測3組UCH-L3基因mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示：與未轉(zhuǎn)染組及pcDNA3.1(+)-EGFP組相比,pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP組的UCH-L3基因mRNA的表達(dá)顯著升高(P0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義；pcDNA3.1(+)-EGFP組與未轉(zhuǎn)染組相比UCH-L3基因mRNA的表達(dá)無顯著差異(P0.05)。 3.western blot方法檢測LC3-Ⅱ和UCH.L3蛋白表達(dá)水平： (1)與不加藥各組相比,加藥后各組的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)都明顯增加,UCH.L3表達(dá)減少(P0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義； (2)未加藥或加藥各組中,pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP組由UCH.L3蛋白表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)染組及pcDNA3.1(+)-EGFP組(P0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,未轉(zhuǎn)染組及pcDNA3.1(+)-EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)； (3)加藥各組中,pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP組與未轉(zhuǎn)染組及pcDNA3.1(+)-EGFP組相比,可見LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)減少(P0.05),未轉(zhuǎn)染組及pcDNA3.1(+)-EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05) 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP質(zhì)粒。 2.雷帕霉素可誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞發(fā)生自噬,并且在自噬過程中UCH-L3蛋白表達(dá)下調(diào)。 3.過表達(dá)UCH-L3可使雷帕霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬過程得到抑制,但其作用的具體機(jī)制還不清楚,有待于進(jìn)一步的研究。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1199942