發(fā)布時(shí)間：2017-11-17 16:07

  本文關(guān)鍵詞：REGγ在氧化蛋白降解中的作用及其相關(guān)靶蛋白研究

  更多相關(guān)文章： REGγ 蛋白酶體 p21 蛋白質(zhì)氧化 血紅蛋白

【摘要】：氧化應(yīng)激會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)受到氧化損傷,影響細(xì)胞的正常生理功能,與神經(jīng)退行性疾病、衰老等疾病的發(fā)生發(fā)展都密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)一些重要調(diào)控蛋白(如p21)的氧化損傷極易引起細(xì)胞功能紊亂,具有重要生物學(xué)功能的血紅蛋白也是容易受到氧化損傷的蛋白質(zhì)。所以,氧化損傷蛋白的清除對(duì)生命活動(dòng)的正常運(yùn)行至關(guān)重要。蛋白酶體系統(tǒng)在應(yīng)答氧化應(yīng)激方面起著重要的作用,它參與損傷蛋白質(zhì)的清除,進(jìn)而降低氧化蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞的毒副作用。本研究證明了一種11S蛋白酶體激活因子-REGγ參與調(diào)控氧化損傷蛋白p21的降解,并初步探究了REGγ對(duì)血紅蛋白的調(diào)控。我們用H202(過氧化氫)處理HeLa和H1299細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)氧化刺激會(huì)使p21的降解速度快于正常情況下的降解,而p21的mRNA水平在蛋白迅速被降解的期間沒有變化。在REGγ穩(wěn)定敲除的穩(wěn)定細(xì)胞系(HeLashR)和REGγ未被敲除的對(duì)照組細(xì)胞(HeLa shN)中,我們驗(yàn)證了REGγ參與對(duì)氧化p21的降解具有促進(jìn)作用。我們分別用不同刺激強(qiáng)度的H2O2(250μM,2mM)和苯肼(5mM,20mM)處理細(xì)胞,證明了氧化p21在shN細(xì)胞系中的被降解速度比在shR細(xì)胞系中快。同時(shí),我們用H202處理A549 shNshR、HepG2、shNshR和MEF REGy+/-RECγ-/-,都得到了與HeLa shNshR相一致的結(jié)果,證明了REGγ對(duì)氧化p21降解促進(jìn)作用在多種細(xì)胞中具有一致性。在用抗氧化劑NAC的預(yù)處理的細(xì)胞檢測(cè)氧化應(yīng)答實(shí)驗(yàn)中,證明了氧化損傷蛋白的降解依賴于底物蛋白的氧化還原性。在氧化降解機(jī)制方面,我們發(fā)現(xiàn)氧化p21的降解是依賴于蛋白酶體的,并且H2O2對(duì)細(xì)胞的的氧化刺激會(huì)使REGγ誘導(dǎo)的蛋白酶體trypsin-like (類胰蛋白酶)酶位點(diǎn)的活性升高,同時(shí)氧化刺激使REGy與20S的互做增強(qiáng),進(jìn)而REGγ蛋白酶體量增多,這一系列分子變化在一定程度上解釋了REGy在促進(jìn)氧化損傷p21降解中的作用。在質(zhì)譜分析REGγ靶蛋白時(shí),發(fā)現(xiàn)REGγ與血紅蛋白亞基δ(HBD)可能存在相互作用,同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道,氧化損傷血紅蛋白在沒有ATP的情況下能被20S蛋白酶降解。我們構(gòu)建了HBD的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞中,同時(shí)過表達(dá)野生型REGγ(REGγ wt)或無功能型REGγ(REGγN151γ),發(fā)現(xiàn)野生型REGy的過表達(dá)會(huì)使HBD蛋白水平下調(diào),無功能REGγ的過表達(dá)會(huì)使HBD蛋白水平上調(diào)。在免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也再次證實(shí)了無功REGγ的過表達(dá)會(huì)使HBD蛋白水平上調(diào),并且HBD與REGγ具有共定位現(xiàn)象。在過表達(dá)HBD的shN和shR細(xì)胞系中,我們發(fā)現(xiàn)REGγ能促進(jìn)氧化刺激下HBD的降解。同時(shí),我們檢測(cè)了年輕小鼠中血紅蛋白相關(guān)組織-骨髓、肝臟和脾臟中血紅蛋白的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)REGy敲除小鼠組織中的血紅蛋白水平高于野生型小鼠,與HBD有相似的結(jié)果。這些結(jié)果表明REGγ肯定對(duì)某些血紅蛋白亞基有直接或間接的調(diào)控,但對(duì)于REGγ如何調(diào)控血紅蛋白的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。上述研究證明了REGγ通過調(diào)節(jié)蛋白酶體活性來影響氧化損傷蛋白質(zhì)的講解。REGγ對(duì)氧化損傷蛋白的調(diào)節(jié)為研究氧化損傷機(jī)制提供了新的研究方向和模型,為衰老和氧化相關(guān)神經(jīng)性疾病提供了一定的分子理論基礎(chǔ)。REGγ對(duì)血紅蛋白的調(diào)節(jié)也為研究血紅蛋白相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1196580