本文關(guān)鍵詞：共表達(dá)GM-CSF和IL-2腺病毒載體的構(gòu)建及在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)

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【摘要】：[背景]：樹突狀細(xì)胞瘤苗是目前最常用的腫瘤特異性T細(xì)胞免疫治療策略之一,而腫瘤原位活化樹突狀細(xì)胞是本領(lǐng)域一個(gè)重要的研究方向,如何將樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞活化因子運(yùn)送至腫瘤局部是有待解決的難題之一。利用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有腫瘤趨向性和低免疫原性的特性,將樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞活化因子導(dǎo)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后運(yùn)送至腫瘤局部表達(dá)可能是解決北述難題的方案之一。 [目的]：構(gòu)建共表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF).GM-CSF和白介素2(Interleukin-2, IL-2)的5型腺病毒載體(Ad5GM-CSF-IL-2),感染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,檢測(cè)GM-CSF和IL-2的表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間,為體內(nèi)活化樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [方法]：實(shí)驗(yàn)于2011-6/2012-12在解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院生物治療中心實(shí)驗(yàn)室完成。用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞后再用RNA提取試劑盒提取總RNA,以此為模板用RT-PCR方法擴(kuò)增GM-CSF和IL-2基因cDNA, PCR擴(kuò)增片段分別插入pcDNA3.1/Myc-His(-)B真核表達(dá)載體中,再利用腦心肌炎病毒內(nèi)部核酸進(jìn)入位點(diǎn)(Internal ribosomal entry sites, IRES)序列,構(gòu)建腺病毒載體穿梭質(zhì)粒pDC515GM-CSF-IRES-IL-2.采用AdMaxTM FLP重組腺病毒載體體系,將穿梭質(zhì)粒pDC515GM-CSF-IRES-IL-2與pBGHfrtΔE1,3FLP骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞,通過(guò)重組酶位點(diǎn)特異性重組獲得Ad GM-CSF-IL-2。Ad GM-CSF-IL-2以100pfu/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)感染常規(guī)培養(yǎng)至第三代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,2h后,經(jīng)10Gy的γ射線照射使其失去增值能力,分別用GM-CSF和IL-2ELISA試劑盒在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞上清中GM-CSF和IL-2蛋白的水平。 [結(jié)果]：經(jīng)測(cè)序證實(shí),克隆獲得的GM-CSF、IL-2cDNA序列分別與GenBank NM000758(435bp)和GenBank NM000586(462bp)提供的序列完全一致。在腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC515的多克隆位點(diǎn)中,通過(guò)IRES序列將GM-CSF和IL-2串聯(lián)起來(lái),構(gòu)成pDC515GM-CSF-IL-2穿梭質(zhì)粒,脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM將上述穿梭質(zhì)粒與pBGHfrtΔEl,3FLP腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293包裝細(xì)胞,通過(guò)293細(xì)胞空斑形成,獲得Ad5GM-CSF-IL-2毒種,凍融裂解后提取DNA,分別用GM-CSF和IL-2引物鑒定,可獲得兩條與GM-CSF和IL-2基因片段大小一致的片段；毒種反復(fù)擴(kuò)增、CsCl純化獲得1010-1011pfu的病毒滴度。以感染復(fù)數(shù)為100pfu/細(xì)胞的Ad5GM-CSF-IL-2感染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,感染12h即可在上清中檢測(cè)到兩種細(xì)胞因子的表達(dá),至48-96h表達(dá)達(dá)到高峰,以后表達(dá)逐步緩慢地下降,至第7天兩種細(xì)胞因子仍然有較高的表達(dá)。 [結(jié)論]：用AdMaxTM FLP重組腺病毒載體可高效、快捷地獲得所要包裝的腺病毒載體,通過(guò)IRES連接GM-CSF和IL-2兩個(gè)基因,均獲得高效表達(dá)。AdGM-CSF-IL-2感染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后可連續(xù)7天高水平的分泌GM-CSF和IL-2。以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為載體細(xì)胞傳送GM-CSF和IL-2的肺瘤面免疫治療有潛在的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 單志新;林秋雄;李曉紅;鄧春玉;周志凌;黃薇;黃曉忠;余細(xì)勇;;腺病毒表達(dá)載體對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年07期

2 曾治中;段曉明;程元星;黃璐;賀修勝;;HA納米載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)hGM-CSF基因的HepG2疫苗誘導(dǎo)的抗瘤效應(yīng)研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年04期

3 陳媛媛;譚曉華;馬晶瑩;;人白細(xì)胞介素12腺病毒載體構(gòu)建及在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2010年23期

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本文編號(hào)：1190003