本文關(guān)鍵詞：皮層細(xì)胞低氧條件液對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究

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【摘要】：研究目的 本研究旨在分析大鼠大腦皮層細(xì)胞不同低氧濃度條件液對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)增殖和分化的影響，并探討PI3-K和JNK這兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在此過(guò)程中發(fā)揮的作用。研究方法 本研究主要分為五個(gè)部分：⑴低氧條件液的制備。分離新生24h內(nèi)的SD大鼠大腦皮層細(xì)胞并進(jìn)行原代培養(yǎng)，，以密度(6.5 7.0)×105細(xì)胞/ml，接種于預(yù)先用0.01%多聚賴氨酸包被的24孔板中，培養(yǎng)5d后進(jìn)行全量換液，并放入4%O2、1%O2和常氧濃度(20.96%O2)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞6h以制備低氧條件液和常氧條件液。⑵觀察和分析低氧條件液對(duì)NSCs增殖的影響。分離生后24h內(nèi)的SD大鼠大腦皮層NSCs，以密度(6.0 6.5)×105細(xì)胞/ml接種于48孔板中。實(shí)驗(yàn)組用低氧條件液培養(yǎng)，對(duì)照組用常氧條件液培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)神經(jīng)球，以分析NSCs的增殖效率，分別于培養(yǎng)24h、48h和72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量神經(jīng)球直徑，以分析NSCs的增殖速度；72h后進(jìn)行Nestin免疫熒光染色鑒定。⑶觀察和分析低氧條件液對(duì)NSCs分化的影響。NSCs分離于生后24h內(nèi)SD大鼠大腦皮層，用Neurobasal培養(yǎng)基添加2%B27和20ng/ml bFGF懸浮培養(yǎng)，48h后獲得NSCs增殖形成的神經(jīng)球，將其轉(zhuǎn)接到預(yù)先用0.01%多聚賴氨酸包被的48孔板中，待神經(jīng)球完全貼壁后進(jìn)行全量換液誘導(dǎo)NSCs分化。實(shí)驗(yàn)組用低氧條件液培養(yǎng)，對(duì)照組用常氧條件液培養(yǎng)。48h后使用免疫熒光雙標(biāo)法鑒定NSCs后代細(xì)胞表型，并分別計(jì)算每種表型細(xì)胞在后代細(xì)胞中所占的比例，以分析不同條件下NSCs的分化情況。⑷分析4%低氧條件液中抑制劑LY294002和SP600125對(duì)NSCs增殖的影響。NSCs分離方法同⑵，實(shí)驗(yàn)分為四組：①低氧條件液組；②DMSO組(向低氧條件液中添加DMSO，其終濃度為0.5%)；③LY294002組；④SP600125組。兩種抑制劑使用前均用DMSO溶解，以10μmol/L終濃度加入低氧條件液中，DMSO終濃度為0.5%。細(xì)胞培養(yǎng)方法及神經(jīng)球計(jì)數(shù)和直徑測(cè)量方法均同⑵。⑸分析4%低氧條件液中抑制劑LY294002和SP600125對(duì)NSCs分化的影響。NSCs分離方法、細(xì)胞培養(yǎng)及計(jì)數(shù)方法均同⑶，實(shí)驗(yàn)分組方法同⑷。⑵⑶⑷中每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞置于37℃、5%CO2、95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 研究結(jié)果 1．低氧條件液對(duì)NSCs增殖的影響：①4%低氧條件液組和常氧條件液組NSCs的增殖效率高于1%低氧條件液組(P0.01)，但前兩者之間沒(méi)有差異；②與常氧條件液組相比，兩個(gè)低氧條件液組均提高了NSCs的增殖速度(P0.01)，且4%低氧條件液NSCs的增殖速度較1%低氧條件液快(P0.01)。 2．低氧條件液對(duì)NSCs分化的影響：在三種條件液培養(yǎng)下NSCs分化出神經(jīng)元的比例均高于星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例；與常氧條件液組比較，4%低氧條件液促進(jìn)了NSCs向神經(jīng)元方向分化(P0.01)，而1%低氧條件液則抑制了NSCs向神經(jīng)元細(xì)胞方向分化(P0.01)。 3．4%低氧條件液中抑制劑LY294002和SP600125對(duì)NSCs增殖的影響：在4%低氧條件液中使用LY294002和SP600125同時(shí)抑制了NSCs的增殖效率和增殖速度，且LY294002抑制作用在24h之后尤為明顯。 4.4%低氧條件液中抑制劑LY294002和SP600125對(duì)NSCs分化的影響：在4%低氧條件液中使用LY294002和SP600125均抑制了NSCs向神經(jīng)元方向分化(P0.01)，且LY294002抑制作用較SP600125大(P0.01)。 研究結(jié)論 大腦皮層細(xì)胞4%氧濃度的低氧條件液能顯著提高NSCs的增殖速度和促進(jìn)大腦皮層NSCs向神經(jīng)元方向分化，PI3-K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在這兩個(gè)過(guò)程中均發(fā)揮主要作用。
【學(xué)位授予單位】：上海體育學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1189831