本文關(guān)鍵詞：青霉素G誘導(dǎo)的Cps持續(xù)性感染對(duì)相關(guān)基因表達(dá)及宿主細(xì)胞凋亡的影響

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【摘要】：目的： 建立鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci，Cps）持續(xù)性感染人子宮頸癌上皮細(xì)胞（HeLa細(xì)胞）的體外研究模型，分析Cps持續(xù)性感染對(duì)Cps相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平及宿主細(xì)胞凋亡的影響，初步探討Cps持續(xù)性感染的分子機(jī)制。 方法： 在MOI為2的Cps感染體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞2h之后，更換含有不同濃度青霉素G的新鮮衣原體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48h，通過(guò)間接免疫熒光染色法對(duì)Cps的感染能力進(jìn)行分析，確定青霉素G誘導(dǎo)Cps持續(xù)性感染的最佳誘導(dǎo)濃度。在青霉素G誘導(dǎo)Cps持續(xù)性感染24h或48h之后，分別采用免疫熒光染色技術(shù)和透射電子顯微鏡計(jì)數(shù)檢測(cè)包涵體的形態(tài)學(xué)變化特征，并研究去除青霉素G后，Cps重新恢復(fù)其感染性的能力。從Cps全基因序列中挑選10個(gè)與Cps的復(fù)制、分裂、代謝、膜結(jié)構(gòu)等相關(guān)的基因（DnaA、DnaK、FtsW、FtsY、GrpE、RpsD、IncC、OmcB、CPSIT_0846、CPSIT_0042），采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)持續(xù)性Cps感染期間衣原體基因的mRNA在不同時(shí)間點(diǎn)（6h、12h、24h、48h、72h）的表達(dá)水平差異。16S rRNA作為內(nèi)參基因。另外，在青霉素G誘導(dǎo)Cps的持續(xù)性感染24h之后，用1μM凋亡誘導(dǎo)劑Staurosporine和溶媒對(duì)照處理細(xì)胞4h，并采用DNA Ladder法、AO/EB染色、Hoechst33258染色，以及流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的凋亡水平進(jìn)行分析。 結(jié)果： （1）用青霉素G處理Cps感染的細(xì)胞，，可誘導(dǎo)Cps出現(xiàn)持續(xù)性感染，其最佳青霉素G誘導(dǎo)濃度為100U/mL。 （2）持續(xù)性感染狀態(tài)下，Cps的包涵體形態(tài)特征較急性感染明顯不同。在急性感染組中，Cps包涵體較大且形態(tài)多樣，包涵體內(nèi)存在大量致密的EB顆粒和少量RB顆粒；而持續(xù)性感染組，衣原體的包涵體偏小且外形偏圓，包涵體內(nèi)的EB顆粒少見或不見，并出現(xiàn)部分異常膨脹變大的RB顆粒;去除青霉素G后，Cps可部分恢復(fù)其感染性。 （3）與Cps急性感染相比較，在持續(xù)性感染狀態(tài)下Cps基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了改變：FtsW、FtsY和CPSIT_0042等基因的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)（P值0.01），DnaA、DnaK、GrpE、RpsD、IncC和CPSIT_0846等基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)（P值0.05），而OmcB等基因的轉(zhuǎn)錄水平幾乎沒(méi)有發(fā)生明顯變化（P值0.05）。 （4）在凋亡誘導(dǎo)劑Staurosporine處理下， Cps持續(xù)性感染細(xì)胞的的凋亡率明顯低于未感染細(xì)胞（P值0.01），但高于Cps急性感染的細(xì)胞（P值0.05）。 結(jié)論： （1）成功構(gòu)建了由青霉素G誘導(dǎo)的Cps持續(xù)性感染的體外細(xì)胞模型。 （2）持續(xù)性感染期間，Cps基因DnaA、DnaK、GrpE、RpsD、IncC、CPSIT_0846、FtsW、FtsY、CPSIT_0042等的mRNA表達(dá)水平發(fā)生了明顯的變化，這可能與Cps持續(xù)性感染期間包涵體的形態(tài)學(xué)特征改變有關(guān)。 （3）Cps持續(xù)性感染可增強(qiáng)細(xì)胞的抗凋亡能力，但持續(xù)性感染對(duì)細(xì)胞抗凋亡的能力的影響不及Cps急性感染。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R374

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本文編號(hào)：1173661