本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)ZnT1基因RNAi對神經(jīng)元BDNF分泌的影響以及自噬凋亡在脊髓損傷后的動態(tài)變化

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【摘要】：目的 設(shè)計針對SD大鼠的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（ZnT1）的siRNA序列，將ZnT1-siRNA序列插入到pFU-GW-iRNA質(zhì)粒中，包裝慢病毒載體，探討其對神經(jīng)元最有效的轉(zhuǎn)染條件并明確不同siRNA序列對神經(jīng)元ZnT1基因表達(dá)的抑制作用。在由不同ZnT1-siRNA序列構(gòu)建的慢病毒載體保證的對ZnT1的不同抑制率的條件下，通過對神經(jīng)元BDNFmRNA以及蛋白的表達(dá)檢測，揭示ZnT1對BDNF/Trkb信號通路的調(diào)控作用，闡明鋅調(diào)控BDNF/TrKB信號通路，促進(jìn)BDNF分泌的機(jī)制。觀察在體水平下，SCI后凋亡自噬相關(guān)基因的動態(tài)變化情況，揭示SCI后凋亡與自噬之間的關(guān)系，同時觀察SCI后自噬基因與ZnT1的變化情況，揭示兩者的統(tǒng)計學(xué)關(guān)系，探討自噬在SCI后鋅轉(zhuǎn)運(yùn)代謝中的作用。 方法 1：通過Genbank獲得SD大鼠ZnT1基因序列，按照siRNA設(shè)計原則設(shè)計3條針對ZnT1的siRNA序列與一條陰性對照（A, B, C, NC），序列兩端含有HpaⅠ與XhoⅠ酶切位點(diǎn)，將pFU-GW-iRNA雙酶切使之線性化，將3條針對ZnT1的siRNA分別插入pFU-GW-iRNA構(gòu)建重組質(zhì)粒（A,B,C,NC），獲得的重組質(zhì)粒行測序鑒定。 2：將獲得的重組質(zhì)粒與慢病毒輔助包裝顆粒pHelper1.0、 pHelper2.0共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，收獲病毒液，根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同，獲得的病毒分別命名LV-ZnT1/shRNA-NC, LV-ZnT1/shRNA-A, LV-ZnT1/shRNA-B和LV-ZnT1/shRNA-C，獲得的病毒行滴度測定。 3：采用酶消化法體外培養(yǎng)SD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞，神經(jīng)特異性烯醇酶（NSE）細(xì)胞免疫組化鑒定其為神經(jīng)細(xì)胞，按照感染復(fù)數(shù)MOI=1,3,6,8分別轉(zhuǎn)染LV-ZnT1/shRNA-NC, LV-ZnT1/shRNA-A, LV-ZnT1/shRNA-B和V-ZnT1/shRNA-C病毒，轉(zhuǎn)染后72h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，，獲取最佳的轉(zhuǎn)染MOI值，收獲最佳MOI值下的受感染神經(jīng)元，Western blot技術(shù)檢測神經(jīng)元中ZnT1的表達(dá)情況，確定各個序列對ZnT1基因表達(dá)的抑制率。 4：將LV-ZnT1/shRNA-NC, LV-ZnT1/shRNA-A, LV-ZnT1/shRNA-B以及LV-ZnT1/shRNA-C病毒分別按照最佳的MOI值轉(zhuǎn)染神經(jīng)元，實(shí)驗(yàn)分為細(xì)胞未處理組（CON組），陰性對照組（NC組），干擾組（ZnT1-siRNA組，其中按照轉(zhuǎn)染干擾序列不同又分為ZnT1-siRNA-A組，ZnT1-siRNA-B組，ZnT1-siRNA-C組），72h后觀察轉(zhuǎn)染效率并收集細(xì)胞，使用RT-PCR, Western blot技術(shù)檢測神經(jīng)元中ZnT1與BDNF在mRNA與蛋白兩個水平的表達(dá)變化情況；ELISA法檢測培養(yǎng)液上清中BDNF的濃度，同時MTT法檢測神經(jīng)元活力的變化情況。 5：選取192只大鼠樣本，動物按隨機(jī)數(shù)目表法分為：假手術(shù)組：僅接受椎板切除術(shù)，不損傷脊髓（n=72）；SCI組：于T10水平使用Allen’s撞擊器（60g.cm）制作SCI模型（n=122）。假手術(shù)組與SCI組按取材時間不同為傷后1h,2h,6h,12h,24h,3d,7d。透射電鏡技術(shù)檢測各個時間點(diǎn)神經(jīng)元微結(jié)構(gòu)的變化情況，同時利用RT-PCR與Western blot技術(shù)檢測各個時間點(diǎn)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ, Bax,Bcl-2, Caspase-3以及ZnT1的表達(dá)變化情況。 結(jié)果 1：設(shè)計了3條（A,B,C）針對SD大鼠鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（ZnT1）的siRNA序列以及一條陰性對照序列（NC），成功的將其插入pFU-GW-iRNA質(zhì)粒中并構(gòu)建了慢病毒載體，獲得了8×108TU/mL的病毒液，其在MOI=6時對神經(jīng)細(xì)胞具有最佳的轉(zhuǎn)染效率（93%）并能保持神經(jīng)細(xì)胞良好的生存狀態(tài)，不同序列的siRNA均能實(shí)現(xiàn)對ZnT1表達(dá)的有效抑制，抑制率分別為47.74±1.40%，81.19±1.36%，94.10±2.41%。 2：A, B, C三種siRNA對神經(jīng)元的ZnT1mRNA的抑制率分別為34.82±9.35%，42.98±4.85%，65.78±1.71%；對ZnT1蛋白的抑制率分別為32.11±1.70%，39.57±2.55%，63.15±3.82%。神經(jīng)元BDNF的表達(dá)量發(fā)生下降，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：BDNFmRNA的表達(dá)量下降了14.91±1.80%，24.46±4.11%，37.10±4.35%；BDNF蛋白的表達(dá)量下降了36.94±2.09%,22.09±1.79%,46.92±1.91%。在mRNA與蛋白水平，ZnT1與BDNF抑制率之間均存在正相關(guān)關(guān)系（mRNA水平：Spearman rho=0.787，P0.01；蛋白水平：Spearman rho=0.453，P=0.030）。ELISA檢測結(jié)果顯示：ZnT1-siRNA各個組中的BDNF含量均有所下降，與CON組以及NC組相比均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05），CON組與NC組之間上清液的BDNF含量之間不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.785）。MTT檢測發(fā)現(xiàn)：慢病毒介導(dǎo)ZnT1-RNAi并沒有引起各組神經(jīng)元生存活力的變化，各組之間不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。 3：脊髓損傷后2h電鏡下可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，線粒體空泡化等損傷表現(xiàn)，損傷后24h在細(xì)胞內(nèi)即可見自噬小體形成，呈雙層或多層膜結(jié)構(gòu)包裹線粒體等細(xì)胞器。自噬標(biāo)志性基因（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）表達(dá)升高，同時凋亡相關(guān)基因Bax, Caspase-3表達(dá)升高，自噬與凋亡之間存在正相關(guān)關(guān)系：在LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與Bax之間，蛋白水平上，Spearman rho=0.448, P=0.014；RNA水平上，Spearman rho=0.787,P0.01；在LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與Caspase-3之間，蛋白水平上，Spearman rho=0.397,P=0.027；RNA水平上，Spearman rho=0.641, P0.01�？沟蛲龌駼cl-2在SCI后表達(dá)升高，而隨著凋亡自噬相關(guān)基因表達(dá)到達(dá)高峰，Bcl-2的表達(dá)反而被抑制，出現(xiàn)了Bcl-2表達(dá)的低谷。 4：Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：在SCI后的24h之內(nèi)，ZnT1的表達(dá)與自噬標(biāo)志性基因（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）存在表達(dá)變化趨勢的一致性，在SCI僅僅1h后即開始升高，在6h左右兩者的表達(dá)開始出現(xiàn)下降，在12h以后兩者的表達(dá)升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在24h出現(xiàn)高峰，而ZnT1的表達(dá)則持續(xù)升高，并且在SCI后的24h之內(nèi)，自噬標(biāo)志性基因LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與ZnT1之間存在正相關(guān)關(guān)系，Spearmanrho=0.829, P=0.042。 結(jié)論 1：設(shè)計了3條針對SD大鼠鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（ZnT1）的siRNA序列，并成功構(gòu)建了慢病毒載體，MOI=6時對神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效率高，雖然不同siRNA序列對ZnT1表達(dá)的抑制效率存在差異，但是均能有效的實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)元ZnT1表達(dá)的抑制。 2： ZnT1表達(dá)的抑制導(dǎo)致了神經(jīng)元BDNF分泌的減少，在mRNA以及蛋白水平，兩者在抑制率上均存在正相關(guān)關(guān)系，同時各組之間的神經(jīng)元活力沒有差異，說明了ZnT1具有調(diào)控BDNF表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)，提示鋅調(diào)控BDNF的分泌是由ZnT1介導(dǎo)。 3：損傷脊髓中出現(xiàn)自噬體的形成，自噬標(biāo)志性基因（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）表達(dá)升高，同時凋亡相關(guān)基因Bax，Caspase-3表達(dá)升高，自噬與凋亡之間存在正相關(guān)關(guān)系，抗凋亡機(jī)制在SCI后啟動以保護(hù)損傷脊髓，但在自噬凋亡的高峰期受其抑制，說明SCI后自噬與凋亡被激活，兩者是相互聯(lián)系的，由于在時間上凋亡晚于自噬，所以自噬有可能存在促進(jìn)凋亡發(fā)生的作用。 4：SCI后的24h之內(nèi)，ZnT1的表達(dá)與自噬標(biāo)志性基因（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）存在表達(dá)變化趨勢的一致性，兩者之間存在正相關(guān)關(guān)系，提示自噬在SCI后的激活有可能在SCI后鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝過程中存在著某種作用。
【學(xué)位授予單位】：遼寧醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：1172362