本文關(guān)鍵詞：1、丙型肝炎病毒核心蛋白通過自誘導(dǎo)方式可溶性表達及其生物學(xué)功能鑒定 2深度測序分析HBV感染中多基因型混合感染

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【摘要】：本論文分成兩部分，均是方法學(xué)研究。第一部分研究了一個新的用于蛋白表達的方法學(xué)，使以往無法表達的HCV完整核心蛋白成功地被可溶性表達，并對該蛋白進行了生物學(xué)鑒定；第二部分研究了高通量測序在臨床基因分型中的應(yīng)用，并以此方法分析了HBV感染中的混合感染問題，證明了其普遍存在性。 第一部分：丙型肝炎病毒核心蛋白通過自誘導(dǎo)方式可溶性表達及其生物學(xué)功能鑒定 目的：構(gòu)建包含丙型肝炎病毒核心蛋白(Core protein)全長基因的重組原核表達質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化表達型大腸桿菌后自誘導(dǎo)（Auto-induction）培養(yǎng)以獲取可溶性重組核心蛋白，并鑒定其基本的生物學(xué)功能，在細胞中表達的活性，以及與其它蛋白的相互作用。 方法：以H/FL質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增全長HCV核心蛋白DNA（573bp）。PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后通過電泳鑒定，再定向克隆到pET28a原核表達載體中。將重組的原核表達載體轉(zhuǎn)化表達型大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，挑選陽性單克隆，并通過自誘導(dǎo)培養(yǎng)的方式使其在高濃度狀態(tài)下表達重組核心蛋白，并轉(zhuǎn)染Huh7細胞后表達。重組核心蛋白經(jīng)Western blot檢測鑒定生物學(xué)功能，單獨通過Ni-NTA親和層析柱純化純化，并與HCV NS3蛋白進行相互結(jié)合后共同純化實驗。 結(jié)果：重組核心蛋白大量存在于表達菌破菌上清中。Western blot顯示其具有核心蛋白抗原性，細胞表達的重組蛋白也具有相同的抗性。重組核心蛋白不能單獨通過Ni-NTA親和層析柱純化，但可以與HCVNS3蛋白結(jié)合后共同純化。 結(jié)論：自誘導(dǎo)的方式成功通過表達了可溶性的重組完整HCV核心蛋白，驗證了細菌和細胞表達重組蛋白具有抗原性。證明了自誘導(dǎo)培養(yǎng)方式對傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方式在HCV完整核心蛋白誘導(dǎo)表達中的優(yōu)越性。重組核心蛋白結(jié)構(gòu)上的特點使其無法單獨被層析柱純化，但利用與HCVNS3蛋白存在相互作用可以使兩者共同純化。本實驗為進一步研究完整HCV核心蛋白特殊的晶體結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，為研究新的HCV臨床抗原檢測應(yīng)用開辟了道路。 第二部分：深度測序分析HBV感染中多基因型混合感染 目的：研究表明HBV基因型影響臨床結(jié)局和抗病毒治療反應(yīng)，不同基因型在HBV感染中有著不同的臨床表現(xiàn)�；蛐偷难芯恳殉蔀镠BV研究新的熱點，而不同基因型混合感染則使HBV感染的臨床表現(xiàn)更復(fù)雜，目前對混合感染的研究還不是很多，因此對混合感染的基因分型研究具有重要的現(xiàn)實意義。為了全面探討基因型混合感染在HBV患者中是否普遍存在，我們采用深度測序技術(shù)，通過對大樣本HBV感染者序列的高通量測序來回答這個問題。 方法：提取共532例HBV慢性感染病人的血清DNA。其中包含218位用阿德福韋治療一年的病人治療前后的血清樣本，以及60位嬰兒的血清樣本和18對母子的血清樣本。PCR擴增產(chǎn)物進行Solexa測序。用我們建立的HBV短序列窗口分型方法對所測序列基因分型。并用Sanger法和克隆測序重復(fù)驗證實驗結(jié)果。統(tǒng)計分析混合感染程度與病毒滴度、年齡、性別、肝功能、e抗原等之間的相關(guān)性。 結(jié)果：532例Solexa檢測標本中基本都是兩種以上基因型混合，混合感染中劣勢基因型比例均大于0.2%，0.5%的占98%，1%的占92.2%，10%的占42.7%。母嬰和母子標本的基因型具有很好的相關(guān)性。對其中96例樣品采用Sanger法直接測序進行驗證，兩種方法的結(jié)果一致。對40例Solexa測序樣品，采用克隆測序進一步驗證，兩種方法的結(jié)果也高度一致。對ADV治療前后出現(xiàn)基因型轉(zhuǎn)換的患者深度測序表明，患者基線時即存在混合感染，，之所以出現(xiàn)優(yōu)勢基因型的轉(zhuǎn)換，推測可能和不同基因型對藥物的反應(yīng)性相關(guān)。對基因型變化量的統(tǒng)計分析表明，C型變化量總體多于B型（P＜0.05）。 結(jié)論：混合感染普遍存在于中國大陸地區(qū),并且主要以B、C型混合為主。混合感染主要以低比例的形式存在�；旌细腥局饕ㄟ^母嬰傳播形成�；旌细腥境潭扰c病毒滴度、性別、肝功能密切相關(guān)。上述研究方法對于其它病毒不同基因型或亞型間混合感染具有重要指導(dǎo)和借鑒意義。至于混合感染為何普遍存在于中國大陸地區(qū)HBV攜帶者中的原因，目前還不清楚，混合感染與疾病轉(zhuǎn)歸及抗病毒療效的關(guān)系也有待進一步研究。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R512.63;R3416

【共引文獻】

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本文編號：1166254