本文關鍵詞：Nodal信號通路NOMO1基因與胚胎心臟發(fā)育關系的研究

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【摘要】：NOMO1 (Nodal Modulator 1)基因定位于人染色體16p13.11區(qū)帶,編碼1222個氨基酸,分子量約130 KD,有研究表明NOMO編碼的蛋白與Nicalin結合形成的復合蛋白,為內質網(wǎng)駐留的轉膜蛋白,該復合物在一定程度上抑制Nodal信號通路,而Nodal信號通路在心臟發(fā)育及其他器官形成中至關重要[1,21。前期研究中,本研究小組應用抑制性差減雜交技術(suppression subtractive hybridization, SSH),分析室間隔缺損(ventricular septal defect, VSD)患者心室肌組織基因表達譜與正常人之間的差異,發(fā)現(xiàn)了551種差異表達基因。其中,NOMO1基因低表達于VSD患者的心室肌組織中,提示NOMO1基因可能與先天性心臟病(congenital heart disease, CHD)的發(fā)生有關[3]。本文為進一步分析NOMO1的功能,首先檢測NOMO1基因在SD大鼠胚胎心臟發(fā)育過程中1mRNA表達變化及定位情況,其次擬以RNA干擾技術(RNA interference, RNAi)沉默NOMO1的表達,以小鼠胚胎癌細胞株(P19細胞)為工具細胞開展體外研究,評價NOMO1表達沉默對心肌細胞分化的影響。分析NOMO1基因的功能及在心臟發(fā)生中的作用將可能有助于闡明CHD的病因,并有助于提高診斷及開發(fā)新的治療策略,并探討其在胚胎心臟發(fā)育的意義。第一部分NOMO1基因在大鼠胚胎心臟發(fā)育過程中的表達目的：檢測NOMO1基因mRNA在SD大鼠胚胎心臟發(fā)育過程中表達豐度及定位變化,并分析其對胚胎心臟發(fā)育的意義。方法：24只孕鼠隨機分為6組,每組4只,分別于妊娠12d(D12)、15d(D15)、 16d (D16)、17d (D17)、19d (D19)、21d (D21)時取出胎鼠,取其心臟,采用實時定量PCR(real-time qRT-PCR)技術檢測心臟組織中NOMO1基因mRNA的表達豐度,并應用熒光原位雜交(FISH)技術對其進行定位分析。結果：在妊娠D12、D15、D16、D17、D19、D21的胚胎心臟中NOMO1基因mRNA均有表達,表達豐度且呈由弱到強再減弱趨勢,表達高峰出現(xiàn)在D16；該基因主要表達于心外膜中,而在心肌層、心內膜、心瓣膜等處未見明顯表達。結論：NOMO1基因mRNA的表達及定位隨大鼠胚胎的心臟發(fā)育呈動態(tài)變化的趨勢,可能與心臟發(fā)育相關。第二部分NOM O1基因表達沉默抑制P19細胞定向分化為心肌細胞目的：探討NOMO1基因表達沉默對P19細胞定向分化為心肌細胞的影響,并分析其在胚胎心臟發(fā)育過程中的作用。方法：①構建小鼠NOMO1 pGPU6/GFP/Neo-shRNA干擾載體,同時設置質粒空載作為陰性對照,轉染P19細胞,G418篩選穩(wěn)定表達株后,以real-time qRT-PCR、Western Blot技術驗證NOMO1在細胞中的mRNA表達及蛋白表達,以此評估NOMO1基因的干擾效率；②穩(wěn)定表達株經(jīng)1%DMSO誘導分化為心肌細胞,于細胞誘導分化D0、D6、D10天,在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化；采用real-time qRT-PCR、Western Blot技術檢測Nodal信號通路相關基因Nodal、Cripto及Smad2基因mRNA及蛋白的表達；采用real-time qRT-PCR技術檢測心肌標志基因CTnT及心肌特異轉錄因子Nkx2.5、GATA4、TBX5基因mRNA的表達,以此評估NOMO1與P19細胞向心肌細胞誘導分化的關系。結果：①DNOMO1干擾組(RNAi組)于P19細胞誘導分化D0、D6、D10天NOMO1 mRNA及蛋白水平表達均顯著低于陰性對照組(NC組),且差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),代表達到了很好的RNA干擾效率；②于倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)誘導分化D5天時兩組均可見一些細胞聚集成團樣生長的胚胎樣小體形成,兩組無明顯區(qū)別,D10天時NC組可見一些搏動的心肌樣細胞形成,而在RNAi組卻很難發(fā)現(xiàn)；與NC組比較,Nodal信號通路相關基因Nodal、Cripto及Smad2基因在RNAi組的mRNA及蛋白表達量于D0、D6、D10天均明顯下降,且差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),且與NC組隨誘導分化過程中表達變化趨勢是一致的；與NC組比較,CTnT、NKX2.5在RNAi組mRNA表達量在D6天略上調,而在D0天、D10天表達量明顯下降,且差異有統(tǒng)計學意義(p0.05); GATA4于RNAi組與NC組比較mRNA 于D0、D6、D10天均明顯下降,且差異有統(tǒng)計學意義；TBX5于RNAi組與NC組比較在DO天略上調,D6天、D10天表達量明顯下降,且差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),該四種基因mRNA的表達水平在RNAi組總體趨勢是下降的。結論：NOMO1基因表達沉默抑制了P19細胞向心肌細胞誘導分化,與心臟發(fā)育密切相關。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R321.5

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